<b>Bijsluiter</b>. De hyperlink naar het originele document werkt niet meer. Daarom laat Woogle de tekst zien die in dat document stond. Deze tekst kan vreemde foutieve woorden of zinnen bevatten en de opmaak kan verdwenen of veranderd zijn. Dit komt door het zwartlakken van vertrouwelijke informatie of doordat de tekst niet digitaal beschikbaar was en dus ingescand en vervolgens via OCR weer ingelezen is. Voor het originele document, neem contact op met de Woo-contactpersoon van het bestuursorgaan.<br><br>====================================================================== Pagina 1 ======================================================================

<pre>Mutageniteitstests met reportergenen
bij dieren
The use of reporter genes for mutagenicity
testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 1 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 2 ======================================================================

<pre></pre>

====================================================================== Einde pagina 2 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 3 ======================================================================

<pre>Gezondheidsraad                             Voorzitter
Health Council of the Netherlands
Aan de minister van Volksgezondheid, Welzijn en Sport
Onderwerp          : aanbieding advies over mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
Uw kenmerk         : GZB/C&O/2268208
Ons kenmerk        : U-1715/EvV/RA/246-D10
Bijlagen           :2
Datum              : 24 januari 2005
Mijnheer de minister,
Hierbij bied ik u een advies aan over mutageniteitstests met reportergenen bij dieren. Het is op
verzoek van uw ambtsvoorganger opgesteld door de Commissie Beoordeling Carcinogeniteit van
Stoffen. Het is beoordeeld door de Beraadsgroep Gezondheid en Omgeving, en enkele
buitenlandse en Nederlandse deskundigen van buiten de Gezondheidsraad.
De commissie concludeert dat testsystemen met reportergenen bij dieren op dit moment niet
geschikt zijn om chemische stoffen gestandaardiseerd te onderzoeken op genotoxische
eigenschappen. Wel ziet zij op dit moment reeds mogelijkheden om de variatie in de wijze waarop
tests met deze systemen worden uitgevoerd te verkleinen. Deze schetst ze op hoofdlijnen. De
verdere uitwerking kan naar haar mening het beste geschieden in OESO-verband.
      Voorbereidingen voor uitwerking van de voorschriften door de OESO worden reeds
getroffen. Ook in het kader van het International Programme on Chemical Safety van de WHO
wordt een rapport over mutageniteitstests met reportergenen bij dieren opgesteld. Ik geef u ter
overweging het advies ter kennisname aan deze organisaties aan te bieden.
Ik heb dit advies vandaag ook aangeboden aan de staatssecretaris van Volkshuisvesting,
Ruimtelijke Ordening en Milieubeheer.
Hoogachtend,
prof dr JA Knottnerus
Bezoekadres                                                             Postadres
Parnassusplein 5                                                        Postbus 16052
2511 VX    Den Haag                                                     2500 BB   Den Haag
Telefoon (070) 340     73 27                                            Telefax (070) 340 75 23
E-mail:  pw.van.vliet@gr.nl                                             www.gr.nl
</pre>

====================================================================== Einde pagina 3 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 4 ======================================================================

<pre></pre>

====================================================================== Einde pagina 4 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 5 ======================================================================

<pre>Mutageniteitstests met reportergenen
bij dieren
aan:
de minister van Volksgezondheid, Welzijn en Sport
de staatssecretaris van Volkshuisvesting, Ruimtelijke Ordening en Milieubeheer
Nr 2005/01, Den Haag, 24 januari 2005
</pre>

====================================================================== Einde pagina 5 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 6 ======================================================================

<pre>De Gezondheidsraad, ingesteld in 1902, is een adviesorgaan met als taak de regering en
het parlement ‘voor te lichten over de stand der wetenschap ten aanzien van vraagstuk-
ken op het gebied van de volksgezondheid’ (art. 21 Gezondheidswet).
     De Gezondheidsraad ontvangt de meeste adviesvragen van de bewindslieden van
Volksgezondheid, Welzijn & Sport; Volkshuisvesting, Ruimtelijke Ordening & Milieu-
beheer; Sociale Zaken & Werkgelegenheid en Landbouw, Natuur & Voedselkwaliteit.
De raad kan ook eigener beweging adviezen uitbrengen. Het gaat dan als regel om het
signaleren van ontwikkelingen of trends die van belang kunnen zijn voor het overheids-
beleid.
     De adviezen van de Gezondheidsraad zijn openbaar en worden in bijna alle gevallen
opgesteld door multidisciplinaire commissies van – op persoonlijke titel benoemde –
Nederlandse en soms buitenlandse deskundigen.
              De Gezondheidsraad is lid van het International Network of Agencies for Health
              Technology Assessment (INAHTA). INAHTA bevordert de uitwisseling en samenwerking
              tussen de leden van het netwerk.
U kunt het advies downloaden van www.gr.nl.
Deze publicatie kan als volgt worden aangehaald:
Gezondheidsraad. Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren. Den Haag: Gezond-
heidsraad, 2005; publicatie nr 2005/01.
Preferred citation:
Health Council of the Netherlands. The use of reporter genes for mutagenicity testing in
animals. The Hague: Health Council of the Netherlands, 2005; publication no. 2005/01.
auteursrecht voorbehouden
all rights reserved
ISBN: 90-5549-552-2
</pre>

====================================================================== Einde pagina 6 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 7 ======================================================================

<pre>    Inhoud
    Samenvatting 9
1   Inleiding 15
1.1 Vraagstelling en commissie 15
1.2 Verantwoording 15
1.3 Indeling van het advies 16
2   Testen op mutageniteit 17
2.1 Invloed op erfelijk materiaal 17
2.2 Detecteren van wijzigingen in het DNA 18
2.3 Nieuwe mutageniteitstests 19
3   Resultaten van nieuwe tests 21
3.1 Selectie van testsystemen 21
3.2 Classificatie van stoffen op basis van klassieke tests 22
3.3 Uitslagen van nieuwe tests 24
3.4 Bijzonderheden in de testopzet 25
3.5 Testprestaties en reproduceerbaarheid van testuitslagen 27
    Inhoud                                                     7
</pre>

====================================================================== Einde pagina 7 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 8 ======================================================================

<pre>4   Conclusies en aanbevelingen 29
4.1 Betrouwbaarheid 29
4.2 Bruikbaarheid voor risicobeoordeling 33
4.3 Aanbevelingen voor verdere validatie en standaardisatie 34
4.4 Aanbevelingen voor inpassing in de gangbare teststrategie 36
    Literatuur 39
    Bijlagen 53
A   Adviesaanvraag 55
B   Commissie 57
C   Begrippenlijst 59
D   Overzicht van stoffen en hun testuitslagen 61
    Engelse vertaling 71
8   Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 8 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 9 ======================================================================

<pre>Samenvatting
Adviesvraag over nieuwe testmethode
Chemische stoffen die het erfelijk materiaal (DNA) in het lichaam kunnen veranderen
hebben zogenoemde genotoxische eigenschappen. Wanneer wijzigingen in het DNA
onomkeerbaar worden, is er sprake van mutaties. In alle soorten lichaamscellen kunnen
deze leiden tot kanker; in geslachtscellen kunnen mutaties bovendien worden doorgege-
ven aan volgende generaties. Het onderzoek naar genotoxische eigenschappen van che-
mische stoffen vormt de basis voor maatregelen om die risico’s te reduceren.
     Genotoxiciteit is vast te stellen met verschillende tests. Belangrijk zijn de mutageni-
teitstests: daarmee kunnen veranderingen in het DNA opgespoord worden. Bij in vivo
tests worden proefdieren blootgesteld aan de te onderzoeken stof, in vitro zijn dit cellen
of micro-organismen. Als in vitro en in vivo onderzoek tegenstrijdige uitslagen laten
zien, geven de bevindingen uit proefdieronderzoek doorgaans de doorslag, omdat dit
dichter bij de mens staat. Verder worden ook indirecte aanwijzingen voor genotoxiciteit
uit onder meer (in vitro of in vivo) onderzoek op de vorming van DNA-adducten (cova-
lente binding aan DNA) meegewogen in het oordeel over genotoxiciteit. In dit advies
zijn de in vivo gegevens eveneens beslissend en staat (niet-)genotoxisch voor
(niet-)genotoxisch in vivo.
     Mutageniteit kan zich uiten in de vorm van chromosoomafwijkingen en genmuta-
ties. Deze treden op als het DNA niet voldoende kan worden hersteld voor de celdeling.
Tot op heden zijn er gestandaardiseerde en praktische in vitro genotoxiciteitstests voor
chromosoomafwijkingen, genmutaties en DNA-herstel. De eerste twee zijn mutageni-
Samenvatting                                                                                 9
</pre>

====================================================================== Einde pagina 9 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 10 ======================================================================

<pre>   teitstests; met de laatste wordt indirect bepaald of een stof al dan niet genotoxisch is.
   Voor chromosoomafwijkingen en voor DNA-herstel zijn er daarnaast in vivo pendanten.
   Een gestandaardiseerde en praktische in vivo test voor genmutaties bestaat echter nog
   niet.
        Wel zijn er inmiddels nieuwe in vivo tests ontwikkeld voor het opsporen van stoffen
   die genmutaties kunnen veroorzaken. Bij de nieuwe tests worden genmutaties gedetec-
   teerd met reportergenen. Dit betekent dat een bepaald gen (drager van een erfelijke
   eigenschap), en niet het totale DNA, op genmutaties wordt onderzocht. De reporterge-
   nen zijn van endogene oorsprong, dat wil zeggen van nature aanwezig, of ze zijn trans-
   geen, dat wil zeggen soortvreemd en via genetische modificatie ingevoegd in het
   endogene DNA.
        De minister van Volksgezondheid, Welzijn en Sport heeft de Gezondheidsraad
   gevraagd of deze nieuwe genmutatietests met dieren geschikt zijn om te gebruiken in het
   routineveiligheidsonderzoek naar chemische stoffen. Een commissie van de Raad heeft
   beoordeeld of ze de genoemde lacune in het veiligheidsonderzoek van stoffen kunnen
   dichten. Voor haar advies heeft zij enkele Nederlandse en buitenlandse deskundigen van
   buiten de Raad geconsulteerd.
   Werkwijze van de commissie
   Om te beoordelen of de mutageniteitstests met reportergenen in proefdieren betrouw-
   bare resultaten geven, heeft de commissie de resultaten uit die nieuwe tests vergeleken
   met de conclusie uit het eerder beschreven klassieke onderzoek op genotoxiciteit. Over-
   eenkomende resultaten geven een indicatie van het vermogen van de nieuwe test om
   genotoxiciteit of het ontbreken hiervan vast te stellen.
        De commissie heeft zich beperkt tot uitspraken over tests met proefdieren met twee
   verschillende transgene reportergenen, omdat alleen daarvoor testuitslagen van vol-
   doende stoffen openbaar zijn om verantwoord conclusies te kunnen trekken over test-
   prestaties als gevoeligheid (kans dat een genotoxische stof positief scoort) en
   specificiteit (kans dat een niet-genotoxische stof negatief scoort).
        De proefdieren met transgene reportergenen waarvoor testresultaten van genoeg
   stoffen zijn gerapporteerd in de literatuur die toegankelijk is via Medline, zijn de ratten-
   en muizenstammen Big Blue® en de muizenstam Muta™Mouse. Er zijn testuitslagen
   van in totaal 64 genotoxische en niet-genotoxische stoffen. De tests zijn echter op uit-
   eenlopende wijze gedaan. Zo verschillen ze bijvoorbeeld qua blootstellingsniveau en
   -duur en qua geanalyseerde organen.
10 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 10 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 11 ======================================================================

<pre>Oordeel over betrouwbaarheid van nieuwe tests
De commissie concludeert uit de testprestaties dat tests met reportergenen bij de gese-
lecteerde ratten- en muizenstammen in beginsel geschikt zijn om stoffen te onderzoeken
op hun vermogen genmutaties te veroorzaken. De betrouwbaarheid van de tests is echter
(nog) onvoldoende voor routinematige toepassing. Ten eerste laten de gegevens geen
afleiding toe van een standaardvoorschrift, waarin de wijze van uitvoering in grote lij-
nen is vastgelegd. Verder zijn de testkenmerken gevoeligheid en specificiteit wel hoog,
maar deze getallen zijn ontoereikend onderbouwd en daarom voorlopig.
     De stoffen waarop de getallen berusten zijn namelijk niet representatief. Er zijn rela-
tief weinig niet-genotoxische stoffen getest en bij de genotoxische stoffen zijn sterk
genotoxische stoffen oververtegenwoordigd. Aan de berekende testkenmerken kent de
commissie daarom slechts indicatieve waarde toe. Verder is de reproduceerbaarheid van
positieve en negatieve uitslagen onvoldoende onderzocht.
     De testkarakteristieken geven de commissie geen aanleiding te veronderstellen dat
de genoemde muizen- en rattenstammen van elkaar verschillen in geschiktheid om
genotoxische en niet-genotoxische stoffen te onderscheiden.
     Er zijn foutnegatieve én foutpositieve uitslagen opgetreden. De oorzaak van de fout-
negatieve resultaten kan liggen in de wijze waarop de test is gedaan, bijvoorbeeld met te
korte blootstelling of expressietijd. Anderzijds zouden deze bevindingen ook verklaard
kunnen worden met relatief lage gevoeligheid van de methode. Beide verklaringen wij-
zen op falen van de nieuwe test.
     Bij de foutpositieve scores zoekt de commissie de verklaring in het tekortschieten
van de onderzoeksmethoden die tezamen als norm hebben gediend. Met de nieuwe test-
systemen kan worden bepaald of stoffen in staat zijn genmutaties in vivo te veroorzaken.
Dit laat zich niet vaststellen met de methoden waarmee ze vergeleken zijn. Daarom
neemt de commissie aan dat het om stoffen gaat die genotoxisch zijn, maar met de
gebruikelijke in vivo tests niet als zodanig zijn herkend. Zij beveelt aan voorlopig een
positieve score in de nieuwe testsystemen te beschouwen als teken van genotoxische
eigenschappen, maar een negatieve score niet als bewijs voor het ontbreken hiervan.
     De foutnegatieve scores bij de voortplantingsorganen vormen een geval apart. De
testsystemen zijn niet geschikt om stoffen op mutageniteit te onderzoeken in geslachts-
cellen in bepaalde stadia van rijping. Dit heeft een technische reden: met een reportergen
is het niet mogelijk om mutagene werking aan te tonen in de stadia na de meiose (reduc-
tiedeling). Stoffen die enkel mutageen zijn in deze stadia scoren daarom negatief in
geslachtscellen.
Samenvatting                                                                                 11
</pre>

====================================================================== Einde pagina 11 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 12 ======================================================================

<pre>   Oordeel over bruikbaarheid in routineveiligheidsonderzoek
   De in vivo testsystemen met transgene reportergenen zijn zeer flexibel. Ze onderschei-
   den zich van de bestaande, gestandaardiseerde in vivo testsystemen doordat in principe
   cellen in alle organen kunnen worden onderzocht behalve in de voortplantingsorganen
   de geslachtscellen in een laat stadium van ontwikkeling. Dit maakt maatwerk mogelijk,
   waardoor de opzet van de proef kan aansluiten bij eerdere toxicologische bevindingen
   over de stof. Dit verkleint de kans op foutnegatieve uitslagen. Routinematige toepassing
   veronderstelt echter een standaardvoorschrift. De beschikbare gegevens laten volgens de
   commissie het opstellen van een dergelijk protocol op dit moment niet toe.
        De commissie concludeert dan ook dat de testsystemen met de genoemde transgene
   dieren (nog) niet gestandaardiseerd inzetbaar zijn. Wel vindt zij de kennis voldoende om
   tests met deze systemen op ad hoc basis toe te laten, mits de opzet ervan goed wordt
   beargumenteerd. De werkwijze moet dus worden afgestemd op de reeds beschikbare
   kennis over de toxiciteit van de te testen stof. Afgezien van geslachtscellen in een laat
   stadium van ontwikkeling komen cellen uit elk orgaan of weefsel in aanmerking voor
   onderzoek.
   Aanbevelingen voor verder onderzoek
   De toekomst zal moeten leren of de tests op den duur met grotere betrouwbaarheid kun-
   nen worden uitgevoerd en volgens een standaardprotocol, of anders in ieder geval met
   minder variatie in werkwijze. De commissie doet enige suggesties voor een proefopzet
   die dit doel naderbij kan brengen. In eerste instantie zou het voorschrift op onderdelen
   vast moeten komen te liggen, bijvoorbeeld welke organen geanalyseerd dienen te wor-
   den bij welke blootstellingsroute. Zo worden de verschillen in proefopzet enigermate
   gereduceerd en wordt het voorschrift bruikbaar voor een breed scala aan stoffen waar-
   van de veiligheid niet of zeer summier is onderzocht. Bij stoffen waarover gegevens
   voorhanden zijn die meer aanknopingspunten bieden voor de proefopzet dient het voor-
   lopig mogelijk te blijven hiervan af te wijken om de proefopzet nauwkeuriger bij deze
   data aan te laten sluiten. De werkwijze moet dus voorlopig in alle gevallen door de
   onderzoeker gemotiveerd worden. Het uitwerken van het protocol kan volgens de com-
   missie het beste in OESO-verband geschieden. Van een volgens OESO-protocol uitge-
   voerde test wordt de uitslag namelijk erkend door alle bij de OESO aangesloten landen.
        Voor het vergroten van de betrouwbaarheid van de testsystemen is het ook nodig
   meer stoffen te testen. Hierbij denkt de commissie aan stoffen waarvan vaststaat dat ze
   zwak genotoxisch zijn. Ook denkt ze aan erkende niet-genotoxische stoffen. Deze twee
   categorieën lopen in aantallen namelijk nog ver achter.
12 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 12 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 13 ======================================================================

<pre>Aanbevelingen voor inpassing in veiligheidsonderzoek
De in vivo tests met transgene reportergenen kunnen hun nut bewijzen als onderdeel van
het genotoxiciteitsonderzoek dat de EU tegenwoordig voorschrijft. De EU verlangt een
dossier met standaard-toxicologische gegevens van de producent of degene die de stof
voor commerciële doeleinden gebruikt of in de handel brengt. Bij het onderdeel geno-
toxiciteit worden de resultaten van stapsgewijs uitgevoerde in vitro en in vivo tests
gevraagd. Welke genotoxiciteitstests in de verschillende stappen toegestaan of verplicht
zijn, wordt bepaald door het productievolume en de toepassing van de stof (bijvoorbeeld
gewasbescherming).
     Ondanks deze verschillen in teststrategie vindt de commissie inzet van de nieuwe
testsystemen voor alle beleidsterreinen met stoffenregelgeving het overwegen waard.
Op enkele hiervan is de test reeds toegestaan mits er sprake is van een goed gemoti-
veerde proefopzet. Voor de overige terreinen beveelt de commissie aan de test met
dezelfde randvoorwaarden toe te laten.
     De test vormt een waardevolle aanvulling op het gangbare testrepertoire, maar is in
verhouding tot de ingeburgerde tests bewerkelijk en tijdrovend. Bovendien ontbreekt
standaardisatie, een belangrijke voorwaarde voor validatie. Daarom vindt de commissie
hem vooralsnog geschikt voor ad hoc aanvulling op de gangbare tests.
Samenvatting                                                                             13
</pre>

====================================================================== Einde pagina 13 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 14 ======================================================================

<pre>14 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 14 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 15 ======================================================================

<pre>Hoofdstuk 1
          Inleiding
1.1       Vraagstelling en commissie
          Mutageniteitstests vormen een vast onderdeel bij het onderzoeken van schadelijke
          eigenschappen van chemische stoffen 1-3. Met mutageniteitstests worden wijzigingen in
          erfelijk materiaal geconstateerd die zijn opgetreden na blootstelling aan deze stoffen.
          Deze wijzigingen kunnen tot onder meer kanker leiden.
               Voormalig minister Borst van Volksgezondheid, Welzijn en Sport heeft de Gezond-
          heidsraad om advies gevraagd over de bruikbaarheid van een nieuw type mutageniteits-
          test (zie bijlage A). Bij dit type test wordt niet het gehele DNA onderzocht, maar slechts
          een deel: het zogenoemde reportergen.
               De voorzitter van de raad heeft de Commissie Beoordeling Carcinogeniteit van
          Stoffen – in dit advies verder aangeduid met ‘de commissie’ – verzocht deze adviesaan-
          vraag te beantwoorden. De huidige samenstelling van de commissie staat vermeld in bij-
          lage B.
1.2       Verantwoording
          De wetenschappelijke basis van het advies wordt gevormd door publicaties verkregen
          met on-line zoeken in PubMed (Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
          query.fcgi). Gezocht is met de trefwoorden ‘mutagens’, ‘mutagenicity tests’, ‘knockout
          mice’, ‘reporter genes’ en ‘genetically modified animals’. Uit de resulterende lijst zijn
          de overzichtsartikelen geselecteerd die een beschouwing bevatten over de bruikbaarheid
          Inleiding                                                                                  15
</pre>

====================================================================== Einde pagina 15 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 16 ======================================================================

<pre>    van de methode voor het routine toxicologisch onderzoek. Zo nodig zijn in die publica-
    ties aangehaalde literatuurbronnen geraadpleegd. Ook geraadpleegd zijn een overzichts-
    rapport van RIVM en TNO, alsmede publicaties van recente datum die niet in de
    overzichten zijn verwerkt. Het literatuuronderzoek is afgesloten op 15 oktober 2004. De
    commissie heeft voor haar advies verder enkele Nederlandse en buitenlandse deskundi-
    gen van buiten de Gezondheidsraad geconsulteerd.
         De omschrijvingen van de sleutelbegrippen in het advies, genotoxiciteit en mutage-
    niteit, zijn aan internationale afspraken ontleend. In het verleden heeft de commissie
    eigen definities gehanteerd 2,3. Inmiddels geeft zij echter de voorkeur aan in internatio-
    naal verband overeengekomen begripsomschrijvingen. De OESO en het International
    Programme on Chemical Safety van de WHO hebben een gezamenlijke begrippenlijst
    voor risicobeoordeling 4. De genoemde begrippen zijn echter nog niet opgenomen in
    deze lijst. Ook het Globally Harmonized System for Classification and Labelling of
    Chemicals van de VN is incompleet 5. Daarom heeft de commissie besloten de definitie
    van genotoxiciteit en die van mutageniteit van de EU over te nemen.
1.3 Indeling van het advies
    Het advies is als volgt opgebouwd. In hoofdstuk 2 wordt achtergrondinformatie gegeven
    over mutageniteit en de testmethoden om die op het spoor te komen. Hoofdstuk 3 bevat
    een beschrijving van nieuwe mutageniteitstests met zogenoemde reportergenen en geeft
    een overzicht van wat bekend is over de testeigenschappen gevoeligheid, specificiteit en
    voorspellende waarde. Daarna wordt in hoofdstuk 4 de bruikbaarheid van de nieuwe
    mutageniteitstests voor routine-onderzoek beoordeeld, en worden aanbevelingen gedaan
    voor verdere validatie en standaardisatie en inpassing in het veiligheidsbeleid van de EU
    voor chemische stoffen. Daarmee is dan de adviesvraag beantwoord.
16  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 16 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 17 ======================================================================

<pre>Hoofdstuk 2
          Testen op mutageniteit
2.1       Invloed op erfelijk materiaal
          Veranderingen in het erfelijk materiaal van organismen, DNA, zijn potentieel nadelig.
          Dergelijke veranderingen kunnen niet alleen spontaan ontstaan, maar ook door bepaalde
          chemische stoffen en sommige vormen van straling teweeg worden gebracht. Deze
          agentia worden daarom genotoxisch genoemd: ze bezitten het vermogen om potentieel
          schadelijke veranderingen in het DNA aan te brengen 6.
               Veranderingen in het DNA zijn omkeerbaar totdat het DNA voorafgaand aan de cel-
          deling wordt verdubbeld. Tot dat moment kunnen de veranderingen namelijk nog door
          zogenoemde DNA-herstelenzymen ongedaan worden gemaakt. Als herstel niet voor de
          verdubbeling van het DNA plaatsvindt, wordt een wijziging onomkeerbaar en vervol-
          gens, bij celdeling, doorgegeven aan dochtercellen.
               Is een verandering in het DNA eenmaal onomkeerbaar, dan spreekt men van een
          mutatie. Hieronder verstaat de commissie een permanente, overdraagbare wijziging in
          de hoeveelheid of structuur van het erfelijk materiaal van cellen of organismen 6. Muta-
          ties in het DNA kunnen in alle lichaamscellen tot kanker leiden. In geslachtscellen kun-
          nen ze bovendien aan volgende generaties worden doorgegeven.
               Mutageen wordt een stof genoemd wanneer uit een test gebleken is dat hij mutaties
          kan veroorzaken. Een dergelijke stof is per definitie genotoxisch. Genotoxiciteit kan
          echter ook blijken uit bijvoorbeeld vorming van DNA-adducten (covalente binding aan
          DNA), een indirecte aanwijzing dat de stof DNA kan beschadigen.
          Testen op mutageniteit                                                                   17
</pre>

====================================================================== Einde pagina 17 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 18 ======================================================================

<pre>         Of stoffen al dan niet genotoxische eigenschappen bezitten is van belang voor het
    beleid. Van genotoxische stoffen wordt aangenomen dat ze geen drempel kennen: een
    blootstellingsniveau waar beneden geen nadelige gezondheidseffecten te verwachten
    zijn 2,3. Niet-genotoxische stoffen worden geacht wel zo’n drempel te kennen. De inde-
    ling van stoffen in genotoxisch en niet-genotoxisch is daarom een van de pijlers van het
    stoffenbeleid op nationaal en EU-niveau.
         Genotoxiciteit is een sterke aanwijzing dat de stof ook kankerverwekkend (carcino-
    geen) is. Geconstateerde genotoxiciteit kan daarom reden zijn om onderzoek naar carci-
    nogeniteit achterwege te laten en van verdere toepassing van de stof af te zien. Indien de
    stof niet gemist kan worden, volgt onderzoek op carcinogeniteit. Bij een positieve uit-
    slag wordt vervolgens een risicoschatting gemaakt om een bovengrens aan de blootstel-
    ling te stellen. Via de genotoxische eigenschappen zijn niet alle veroorzakers van kanker
    te herkennen. Er zijn namelijk ook stoffen waarvan de carcinogeniteit op andere mecha-
    nismen berust dan wijziging van het erfelijk materiaal. Dit zijn de zogenoemde niet-
    genotoxische carcinogenen.
         Bewijs voor genotoxiciteit in geslachtscellen vormt de basis voor specifieke over-
    heidsmaatregelen. Zo is toepassing van een stof in consumentenproducten verboden als
    is aangetoond dat deze mutageen is én de voortplantingsorganen van de blootgestelde
    kan bereiken 7. Gebruik voor dat doel is ook niet geoorloofd wanneer de mutageniteit
    rechtstreeks in geslachtscellen is gedemonstreerd.
2.2 Detecteren van wijzigingen in het DNA
    De genotoxische werking van een stof detecteren onderzoekers met genotoxiciteitstests.
    Die vallen uiteen in twee groepen: tests waarmee men mutageniteit aantoont en tests
    waamee andere variabelen dan mutaties worden gedetecteerd. Tot de laatste behoort bij-
    voorbeeld een test op Unscheduled DNA Synthesis (UDS). Die detecteert DNA-herstel-
    synthese – een indirect bewijs voor genotoxiciteit.
         Tests waarmee mutageniteit kan worden vastgesteld zijn er in soorten en maten: in
    vitro, met cellen of micro-organismen, en in vivo, met proefdieren. Eventueel kunnen de
    tests in stappen worden uitgevoerd. Dit wil zeggen dat na een beperkt aantal tests kan
    worden besloten een stof niet verder te onderzoeken wanneer de resultaten erop wijzen
    dat de stof genotoxisch is en daarom wordt besloten de stof niet te gebruiken of het
    gebruik ervan te staken. Bij tegenstrijdige uitslagen in vitro en in vivo geven de laatste
    in het algemeen de doorslag, omdat ze meer over de mens zeggen 2. De reden is dat in
    het laatste geval proefdieren worden blootgesteld en niet slechts cellen van mens of dier,
    of micro-organismen. Zo worden ook stoffen herkend die zelf niet genotoxisch zijn,
    maar in voornamelijk de lever worden omgezet in metabolieten die dat wel zijn. Boven-
    dien worden lichaamscellen op fysiologische wijze blootgesteld.
18  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 18 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 19 ======================================================================

<pre>         Mutageniteitstests verschillen in de aard van de mutaties die ermee wordt aange-
    toond. Mutaties zijn onder te verdelen in genmutaties en chromosoomafwijkingen 2.
    Genmutaties zijn veranderingen binnen een gen*, zoals basepaarsubstituties (vervanging
    van baseparen in het DNA door andere baseparen) en kleine deleties (verlies van stukjes
    DNA). Chromosoomafwijkingen zijn het gevolg van breuken in de chromosomen of van
    een onjuiste verdeling van de chromosomen tussen de dochtercellen tijdens de celdeling.
         Voor een beperkt aantal mutageniteitstests heeft de EU de wijze van uitvoering in
    het kader van haar stoffenbeleid vastgelegd in voorschriften, die vrijwel allemaal zijn
    overgenomen van de OESO. Van een volgens OESO-protocol uitgevoerde test wordt de
    uitslag erkend door alle bij de OESO aangesloten landen, dus door onder meer de lidsta-
    ten van de EU, de VS, Canada, Australië en Japan. OESO-voorschriften zijn er voor
    diverse in vitro tests op genmutaties en chromosoomafwijkingen. Ze bestaan ook voor
    enkele in vivo tests, zoals de micronucleustest, die chromosoombreuken en -verlies
    detecteert, en de reeds genoemde test op UDS.
         Tot nu toe zijn er echter geen gestandaardiseerde in vivo tests voor genmutaties. Een
    uitzondering is de vlekkentest**. Deze test vergt echter veel proefdieren en is daarom
    niet in zwang. In plaats hiervan doet men vaak de test op UDS. De tests die in dit advies
    centraal staan lijken in de lacune van de in vivo test voor genmutaties te kunnen voor-
    zien. In de volgende paragrafen worden ze geïntroduceerd, waarna in hoofdstuk 3 de
    testprestaties worden besproken en in hoofdstuk 4 een oordeel wordt gegeven over de
    bruikbaarheid voor de risicobeoordeling.
2.3 Nieuwe mutageniteitstests
    Er zijn verscheidene nieuwe in vivo tests met muizen en ratten voor het aantonen van
    genmutaties. Een overzicht hiervan geeft een recent RIVM/TNO-rapport 8. Kenmerkend
    voor de tests is dat een specifiek gen, het zogenoemde reportergen, op mutaties wordt
    onderzocht, en niet het totale DNA. Op grond van het soort reportergen kunnen de tests
    worden ingedeeld in twee groepen, die hier beide besproken worden. Het ene type test
    maakt gebruik van endogene reportergenen, die van nature in de proefdieren aanwezig
    zijn, het andere van vreemde (transgene) reportergenen, die via genetische modificatie
    in het normale DNA zijn ingevoegd.
*    drager van een erfelijke eigenschap
**   genmutaties worden gedetecteerd als vlekken in de vacht met afwijkende kleur
    Testen op mutageniteit                                                                     19
</pre>

====================================================================== Einde pagina 19 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 20 ======================================================================

<pre>   Endogene reportergenen
   Bij tests gebaseerd op endogene reportergenen gaat het in de meeste gevallen om genen
   die coderen voor de enzymen hypoxantine-fosforibosyl-transferase (HPRT), thymidine-
   kinase (TK) en adenosine-fosforibosyl-transferase (APRT). De detectie van mutaties
   berust op het verloren gaan van de enzymfunctie door de mutatie.
        Het HPRT-gen ligt op het X-chromosoom. Aangezien mannelijke en vrouwelijke
   cellen beide één actief allel bevatten, kan detectie geschieden met normale, niet gene-
   tisch gemodificeerde muizen- of rattenstammen. De TK- en APRT-genen daarentegen
   liggen op andere chromosomen dan de geslachtschromosomen. Van deze genen zijn
   beide allelen actief. Aangezien mutaties in deze genen recessief overerven, zijn met de
   zogenoemde knockouttechniek muizenstammen gecreëerd die in alle lichaamscellen
   nog slechts een van de twee actieve allelen bezitten. Met deze stammen kunnen even-
   eens mutaties worden gedetecteerd doordat werkzaam enzym ontbreekt. In dat geval is
   er dus sprake van een endogeen reportergen én genetische modificatie van de proefdie-
   ren.
        De mutatiefrequentie, dat wil zeggen het aantal mutaties per reportergenkopie,
   wordt bepaald in organen of weefsels waarvan de cellen in kweek kunnen worden
   gehouden, zoals de milt. Hiertoe worden de cellen gekweekt op een voedingsbodem met
   een substraat dat door het enzym HPRT, TK of APRT wordt omgezet tot een toxisch
   product. Cellen met mutaties produceren het desbetreffende enzym niet en kunnen dus
   overleven, ongemuteerde cellen produceren het wel en gaan dood.
   Transgene reportergenen
   Het andere type test maakt gebruik van muizen- en rattenstammen met een transgeen
   reportergen van bacteriële oorsprong. Dit gen zit in alle lichaamscellen. Om de mutatie-
   frequentie te bepalen wordt het totale DNA uit een orgaan of weefsel geïsoleerd. Hierna
   wordt het reportergen geïsoleerd en ‘verpakt’ in een bacteriofaag of plasmide. Vervol-
   gens wordt dit pakket in een bacteriestam gebracht die het bewuste reportergen mist. De
   bacteriën worden onderworpen aan een kleurtest waarin alleen bacteriën met een gemu-
   teerd reportergen kleuren, of dat juist niet doen. Ook kunnen ze op een voedingsbodem
   worden gezet waarop alleen de mutanten kunnen overleven. Aangezien DNA kan wor-
   den gewonnen uit elk orgaan, kent deze variant in beginsel geen weefselrestrictie.
        Voor dit type test zijn het meest in zwang Muta™Mouse (MM), een muizenstam
   met het reportergen lacZ, en Big Blue® -muizen en -ratten (BB), dragers van het repor-
   tergen lacI.
20 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 20 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 21 ======================================================================

<pre>Hoofdstuk 3
          Resultaten van nieuwe tests
          Uit de beschikbare wetenschappelijke literatuur kan worden afgeleid in hoeverre stoffen
          met en stoffen zonder genotoxische eigenschappen te herkennen zijn met de nieuwe
          mutageniteitstests op basis van reportergenen. De resultaten van deze twee groepen stof-
          fen in de bewuste tests kunnen namelijk vergeleken worden met wat al uit klassiek
          onderzoek bekend is over de genotoxiciteit. Voordat de commissie in dit hoofdstuk
          bespreekt tot welke bevindingen ze met deze werkwijze is gekomen, verantwoordt ze
          eerst nog welke testsystemen op basis van reportergenen ze heeft beoordeeld.
3.1       Selectie van testsystemen
          De testsystemen met van nature aanwezige en ingebrachte reportergenen hebben beide
          voor- en nadelen. Bij endogene reportergenen kan men alleen organen bestuderen waar-
          van de cellen kunnen worden gekweekt. Daartegenover staat het voordeel van een lage
          frequentie van spontane mutaties.
               De transgene systemen hebben als belangrijkste voordeel dat in beginsel alle orga-
          nen en orgaansystemen voor analyse in aanmerking komen. Wel verschillen ze in het
          gemak waarmee het DNA daaruit kan worden gewonnen en de hoeveelheid van het
          reportergen die kan worden verkregen. De keuzevrijheid bij organen kan van belang zijn
          als men op grond van voorkennis over een stof het onderzoek op bepaalde organen wil
          richten.
               Het voornaamste nadeel van transgene systemen is een hoog aantal spontane muta-
          ties per kopie van het – in elke lichaamscel in veelvoud aanwezige – reportergen. Dit
          Resultaten van nieuwe tests                                                              21
</pre>

====================================================================== Einde pagina 21 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 22 ======================================================================

<pre>    kan wellicht als volgt verklaard worden. Bij transgene systemen wordt de mutatiefre-
    quentie uiteindelijk afgelezen in bacteriën. In de bacteriën kan het reportergen nog
    mutaties oplopen 9,10. Bij endogene systemen ontbreekt de stap met de bacteriën. Dit
    verklaart waarschijnlijk waarom de transgene systemen een hogere spontane mutatiefre-
    quentie vertonen dan de endogene. Mogelijk kunnen ze hierdoor een kleiner percentage
    genotoxische stoffen detecteren. Onderzocht is dit echter niet.
          Hoewel ze tijdrovender en bewerkelijker zijn dan de gebruikelijke in vivo mutageni-
    teitstests, vindt de commissie de nieuwe methodieken met reportergenen veelbelovend
    voor het onderzoek naar de genotoxische eigenschappen van stoffen. In beginsel zijn
    alle varianten geschikt voor dit doel. Er zijn geen wetenschappelijke redenen om
    bepaalde varianten uit te sluiten.
          Toch heeft de commissie niet alle genetisch gemodificeerde muizen- en rattenstam-
    men beoordeeld waarmee een genmutatietest kan worden uitgevoerd. Ze bespreekt
    alleen de testresultaten met genetisch gemodificeerde muizen- en rattenstammen waarin
    voldoende stoffen zijn getest om verantwoord conclusies te kunnen trekken. Dit bleek
    slechts voor de transgene BB en MM te gelden. Hiervoor zijn testuitslagen beschikbaar
    van circa honderd stoffen 11-13. Voor dit advies vallen onder BB en MM de commercieel
    verkrijgbare stammen en de ouderlijnen waarvan deze nakomelingen zijn. In enkele
    overzichtsartikelen wordt hun betekenis voor het opsporen van carcinogene eigenschap-
    pen besproken 11,13. De commissie concentreert zich echter op de genotoxische eigen-
    schappen. De reden is dat de testsystemen mutageniteit detecteren en dat het verband
    tussen carcinogeniteit en (deze uiting van) genotoxiciteit niet één op één is. Er zijn
    immers ook niet-genotoxische carcinogenen.
          Verder heeft de commissie een beperking aangebracht in het aantal stoffen waaraan
    zij haar conclusies ontleent. Er zijn testuitslagen beschikbaar van zo’n honderd stoffen
    11-13
          . De commissie heeft zich echter uitsluitend een oordeel gevormd op basis van de
    stoffen waarvoor proefopzet en uitslag gerapporteerd zijn in de literatuur die toeganke-
    lijk is via Medline. Voorwaarde was adequate uitvoering en rapportage. Mengsels en
    ioniserende straling zijn buiten beschouwing gelaten.
          Tot slot is de evaluatie beperkt tot de lacI- en lacZ-genen van BB respectievelijk
    MM. Het vreemde DNA van BB en van de MM-variant met een bacteriofaag als vector
    bevat nog wel een tweede reportergen: cII. Dit gen heeft de commissie echter buiten
    beschouwing gelaten, omdat het bij slechts een vijftiental stoffen op genmutaties is
    onderzocht. Bij lacI en lacZ ligt dat aantal op minstens veertig.
3.2 Classificatie van stoffen op basis van klassieke tests
    Bijlage D geeft een overzicht van de 85 stoffen die de commissie heeft gebruikt als
    toetssteen voor de betrouwbaarheid van de nieuwe testsystemen met reportergenen. In
22  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 22 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 23 ======================================================================

<pre>  de tabel zijn weergegeven de uitkomst van het traditionele onderzoek naar de genotoxi-
  citeit en de carcinogeniteit en de resultaten in tests met de proefdierstammen BB en
  MM. Genotoxiciteit in vitro, in vivo en in totaal zijn vermeld. Bij dit totaaloordeel
  geven, zoals eerder uiteen is gezet, de in vivo bevindingen de doorslag. De eindconclu-
  sie ‘(niet-)genotoxisch’ is daarom synoniem met ‘(niet-)genotoxisch in vivo’. Het oor-
  deel of een stof genotoxisch is, is niet alleen gebaseerd op zijn scores* in gangbare
  genotoxiciteitstests. Ook de resultaten van onderzoek dat indirecte informatie verschaft
  over mogelijke genotoxische eigenschappen zijn in het oordeel betrokken. Bijvoorbeeld
  onderzoek naar de vorming van DNA-adducten.
       Het oordeel over de genotoxiciteit dient als maatstaf voor de prestaties van BB en
  MM als testsysteem voor mutageniteit. Het is ontleend aan eerdere adviezen van de
  Gezondheidsraad of aan rapporten van de voormalige Werkgroep van Deskundigen van
  het Ministerie van Sociale Zaken en Werkgelegenheid, die in 1995 is opgegaan in de
  Gezondheidsraad. Bij het ontbreken hiervan is de conclusie gebaseerd op een monogra-
  fie van het ‘International Agency for Research on Cancer (IARC)’ in Lyon. Als ook een
  dergelijk document ontbreekt, berust het oordeel op de originele publicaties. Indien er
  een IARC-document is, staat in de kolom ‘carcinogeniteit’ naast de score ook vermeld
  de bewijskracht dat het om een carcinogeen gaat.
       Sommige van de geraadpleegde overzichtsdocumenten zijn van ouder datum. Dit is
  in de meeste gevallen geen bezwaar, omdat het om publicaties gaat waaruit genotoxi-
  sche eigenschappen gebleken zijn. Het oordeel ‘genotoxisch’ zou door nieuwere rappor-
  tages niet herzien worden. In de overige gevallen is de recente literatuur geraadpleegd
  voor aanvullende (in vivo) gegevens. Dit deed zich voor bij 4-aminobifenyl, 2-amino-
  9H-pyrido[2,3-b]indool, asbest, 4-chloor-o-fenyleendiamine, isopropylmethaansulfo-
  naat (IPMS), 7-methoxy-2-nitronaftho[2,1-b]furaan, 2-nitro-p-fenyleendiamine en qui-
  noline. Indien de in vivo genotoxiciteit niet of niet voldoende is onderzocht, ontbreekt
  een eindoordeel en is de stof ondergebracht in de restcategorie.
       Uiteindelijk zijn dus drie groepen onderscheiden: genotoxische stoffen, niet-geno-
  toxische stoffen en een restgroep waarvan, als gevolg van hiaten in de gegevens, vol-
  gens de commissie niet met voldoende zekerheid te bepalen is of ze genotoxische
  eigenschappen bezitten. Op grond van de geschetste criteria voor genotoxiciteit heeft zij
  52 stoffen genotoxisch bevonden en 12 niet-genotoxisch. Eenentwintig heeft zij niet
  ingedeeld.
* positief wil zeggen mutageen/genotoxisch, negatief niet mutageen/genotoxisch
  Resultaten van nieuwe tests                                                               23
</pre>

====================================================================== Einde pagina 23 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 24 ======================================================================

<pre>3.3 Uitslagen van nieuwe tests
    Uitvoering van de tests en interpretatie van de resultaten
    De proeven zijn op uiteenlopende wijze uitgevoerd. Zo varieert de blootstelling qua
    route, schema en niveau. Ook verschilt bijvoorbeeld de expressietijd (de tijd tussen het
    beëindigen van de blootstelling en het doden van de dieren en uitnemen van hun orga-
    nen), en zijn verschillende organen onderzocht. Het aantal onderzochte organen bijvoor-
    beeld varieert van een tot elf. En het aantal dieren per groep loopt uiteen van twee tot
    tien.
         Bijlage D laat de verschillen in proefopzet niet zien, met uitzondering van de orga-
    nen die zijn onderzocht. Achter elk orgaan is de uitkomst vermeld, uitgedrukt als de
    mutatiefrequentie van behandelde dieren gedeeld door die van controledieren. Dit quo-
    tiënt loopt uiteen van 0,5 tot 90. De stoffen scoren dus van negatief tot zeer sterk posi-
    tief. Doorgaans zijn de overeenkomstige organen van de verschillende dieren in een
    groep afzonderlijk geanalyseerd en zijn de resultaten statistisch bewerkt. In een aantal
    gevallen zijn ze echter gepoold onderzocht of ontbreekt informatie waaruit kan worden
    afgeleid hoe de onderzoekers tot hun eindconclusies zijn gekomen. Dan is het, zeker bij
    de quotiënten tot zo’n twee, niet mogelijk vast te stellen of het om een reële verhoging
    gaat. De commissie beschouwt getallen tot twee als niet verhoogd, tenzij ze statistisch
    significant zijn bevonden.
         De resultaten van de tests in BB en MM zijn als volgt verkregen. Een stof is in een
    orgaan (of weefsel) als genotoxisch beoordeeld wanneer hij de mutatiefrequentie ver-
    hoogt ten opzichte van de controlegroep. De stof heeft een positieve score gekregen als
    hij in minstens een van de onderzochte organen (of weefsels) – bij enige dosis, tijdsduur,
    et cetera – een verhoogde mutatiefrequentie liet zien. De score is negatief als in geen van
    de geteste organen extra mutaties zijn opgetreden. Bij BB is aangegeven of ratten of
    muizen voor de test zijn gebruikt.
    Testresultaten voor genotoxische stoffen
    Wat zijn de resultaten van de nieuwe tests als het gaat om het detecteren van genotoxici-
    teit? Van de 52 genotoxische stoffen scoren er 49 positief. Dus ondanks de uiteenlo-
    pende proefopzet worden genotoxische stoffen vrijwel allemaal als zodanig herkend. De
    drie negatief scorende genotoxische stoffen – arseentrioxide, methylbromide en hydrazi-
    nesulfaat – zijn eenmaal getest, in vier, respectievelijk drie en twee organen. Van de
    overige 49 is ruim de helft meermaals getest. De meeste hiervan vertonen consistent
    positieve scores. Zes echter laten tegenstrijdige bevindingen zien: acrylamide, afla-
24  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 24 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 25 ======================================================================

<pre>    toxine, cyclofosfamide, ethylmethaansulfonaat (EMS), N-hydroxy-2-acetylaminoflu-
    oreen en methylmethaansulfonaat (MMS).
         Verscheidene stoffen in deze groep zijn sterk genotoxisch. Een deel hiervan is ook
    sterk positief gebleken in een reeks organen van BB of MM. Enkele worden inmiddels
    als positieve controle ingezet. Als gevolg hiervan zijn er van deze stoffen extra veel test-
    uitslagen bekend. N-ethyl-N-nitroso-ureum (ENU) is hiervan een voorbeeld.
    Testresultaten voor niet-genotoxische stoffen
    Hoe presteren de nieuwe testsystemen bij het herkennen van niet-genotoxische stoffen?
    Zeven van de twaalf niet-genotoxische stoffen laten negatieve scores zien. Vijf hebben
    positief gescoord. Hieronder is fenobarbital, dat vier maal is getest. Het scoorde drie
    keer negatief en eenmaal (zwak) positief. Ook methylclofenapaat en tetrachloormethaan
    zijn herhaald getest. Beide zijn negatief gebleken in twee proeven.
3.4 Bijzonderheden in de testopzet
    Selectie van organen
    Hét kenmerk van de proefdierstammen BB en MM is dat men de te analyseren organen
    kan kiezen. Dit wordt weerspiegeld in het scala aan organen dat is onderzocht. Bij de
    orgaankeuze is rekening gehouden met onder meer de wijze van toediening. In het geval
    van inhalatieproeven bijvoorbeeld zijn in elk geval de longen onderzocht. Een ander cri-
    terium was bijvoorbeeld de mogelijkheid te vergelijken met gestandaardiseerde tests:
    beenmerg (micronucleustest) of lever (UDS). Bij carcinogene stoffen zijn meestal de
    organen onderzocht waarvan bekend is dat de stof er tumoren kan doen ontstaan. Dit
    geldt zowel bij de genotoxische als bij de niet-genotoxische carcinogenen.
         Maar ook niet-doelorganen zijn bestudeerd. Bij de onderzochte niet-genotoxische
    stoffen ontstaan de tumoren in de meeste gevallen in de lever; dit orgaan is bij deze
    groep dan ook het meest onderzocht. In het algemeen kunnen genotoxische stoffen
    tumoren doen ontstaan in diverse organen. Bij deze categorie zijn ook gemiddeld meer
    organen onderzocht. De geanalyseerde organen weerspiegelen dus in belangrijke mate
    de aanwezige voorkennis.
         Door de grote variatie in de onderzochte organen zijn geen algemene conclusies
    over de orgaanscores te trekken.
    Resultaten van nieuwe tests                                                                  25
</pre>

====================================================================== Einde pagina 25 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 26 ======================================================================

<pre>   Detectie in geslachtscellen
   Bij de onderzochte organen nemen de voortplantingsorganen een bijzondere plaats in,
   omdat mutaties in geslachtscellen aan volgende generaties kunnen worden doorgegeven.
   Bewijs dat een stof mutageen is in geslachtscellen leidt daarom tot strengere beperkin-
   gen aan het gebruik ervan dan mutageniteit in andere celtypen.
        De geslachtscellen van mannelijke dieren zijn door hun veel grotere celdelingscapa-
   citeit meer geëigend voor onderzoek van stoffen op mutagene eigenschappen dan
   geslachtscellen van vrouwelijke dieren. Daarom is van diverse stoffen het effect op de
   mutatiefrequentie in de voortplantingsorganen van mannelijke dieren onderzocht. De
   mutatiefrequentie is bepaald in testis (zaadbal) en epididymis (bijbal), of hieruit gewon-
   nen zaadkanalen of zaadcellen. Deze preparaten bevatten geslachtscellen en steunweef-
   sel (stroma) in verschillende verhoudingen. Veiligheidshalve behandelt de commissie de
   uitslagen van al deze preparaten als afkomstig van geslachtscellen.
        Onder de onderzochte stoffen zijn bewezen geslachtscelmutagenen bij de muis als
   ENU, EMS, IPMS, MMS en MNU. Deze stoffen zijn sterk positief gebleken in klas-
   sieke in vivo genotoxiciteitstests gericht op geslachtscellen, zoals de specifieke-locus-
   test en de dominant-letaaltest (zie onder meer 14-21).
        ENU, IPMS en MMS zijn het uitvoerigst getest. ENU en IPMS hebben steeds posi-
   tief gescoord. MMS is in de overgrote meerderheid van de tests negatief gebleken;
   slechts eenmaal scoorde het (zwak) positief. EMS en MNU zijn beide eenmaal getest en
   daarbij positief gebleken. Dus van de genoemde geslachtscelmutagenen valt er één op
   door (veelvuldig) negatief te scoren.
   Detectie in proefdierstammen BB versus MM
   Van de genotoxische stoffen zijn er 17 in BB én MM getest. N-hydroxy-2-acetyl-ami-
   nofluoreen is de enige hiervan die een discrepantie tussen beide testsystemen laat zien
   (positief in BB, negatief in MM).
        Van de niet-genotoxische stoffen zijn er drie in beide diersoorten getest. Twee
   waren consistent negatief; de derde, fenobarbital, was negatief in BB, maar (zwak) posi-
   tief in een van de twee tests in MM. De mutatiefrequentie was 1,4 maal verhoogd, wat in
   dit geval statistisch significant was.
   Detectie in BB-ratten versus BB-muizen
   Vijf genotoxische stoffen zijn getest in BB-ratten en -muizen. Daarvan scoorden er vier
   positief in beide. De vijfde, aflatoxine, bleek positief in ratten en negatief in muizen.
        Niet-genotoxische stoffen die in beide systemen zijn getest, zijn er niet.
26 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 26 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 27 ======================================================================

<pre>3.5 Testprestaties en reproduceerbaarheid van testuitslagen
    Testprestaties
    De commissie heeft voor BB-ratten en -muizen en voor MM afzonderlijk de testkenmer-
    ken gevoeligheid, specificiteit en positieve en negatieve voorspellende waarde geanaly-
    seerd. Met gevoeligheid wordt de kans bedoeld dat een genotoxische stof positief scoort,
    met specificiteit de kans dat een niet-genotoxische stof negatief is. Een hoge gevoelig-
    heid betekent dat er weinig foutnegatieve uitkomsten zijn; bij een hoge specificiteit zijn
    er weinig foutpositieve bevindingen. De positieve voorspellende waarde is de kans dat
    een stof die positief scoort ook daadwerkelijk genotoxisch is. De negatieve voorspel-
    lende waarde ten slotte is de kans dat een negatieve score betekent dat de stof niet geno-
    toxisch is.
         De testkenmerken zijn samengevat in tabel 1. De aantallen stoffen vond de commis-
    sie te klein om berekeningen voor BB-rat en -muis apart te maken. Daarom zijn bij BB
    de gegevens van muis en rat tezamen gebruikt. Diverse stoffen zijn meermaals getest en
    laten tegenstrijdige uitkomsten zien. Aangezien deze stoffen op één na allemaal geno-
    toxisch zijn, zouden de testprestaties bij het eindoordeel ‘positief’ aanzienlijk gunstiger
    uitvallen dan bij ‘negatief’. Voor het samenstellen van de tabel zijn daarom berekenin-
    gen met beide uitkomsten gemaakt. Er is dus niet gewerkt met de resultaten van de
    afzonderlijke tests. Dan zouden stoffen die vaak zijn onderzocht namelijk extra zwaar
    meetellen. De stoffen met tien of meer scores zijn allemaal genotoxisch en de groep van
    de genotoxische stoffen domineert de testkarakteristieken toch al.
         Uit de tabel blijkt dat de testsystemen BB en MM worden gekenmerkt door hoge
    gevoeligheid en redelijk hoge specificiteit. Verder is de positieve voorspellende waarde
    van tests met deze dieren groot. Hun negatieve voorspellende waarde daarentegen loopt
    sterk uiteen. Hoe bij tegenstrijdige testuitkomsten de eindscore luidt is van invloed op de
    getallen. De meeste percentages zijn wat lager bij ‘negatief’ dan bij ‘positief’.
    Resultaten van nieuwe tests                                                                 27
</pre>

====================================================================== Einde pagina 27 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 28 ======================================================================

<pre>Tabel 1 Karakteristieken van de tests met BB en MM voor het herkennen van genotoxische en niet-genotoxische stoffen
Karakteristiek                                                                       Uitkomst
                                                                       a
                                                           BB (n=43)                                        MM (n=40)
                                                   %                       fractie                     %                     fractie
                                                    b
gevoeligheid                                    100          (91)        32/32     (29/32)           89        (81)         32/36 (29/36)
specificiteit                                     64         (64)         7/11       (7/11)          75       (100)            3/4    (4/4)
positieve voorspellende waarde                    89         (91)        32/36     (29/33)           97       (100)         32/33 (29/29)
negatieve voorspellende waarde                   100         (70)          7/7       (7/10)          43         (36)           3/7   (4/11)
a
     aantal stoffen
b
     stoffen met tegenstrijdige testuitslagen gescoord als positief. Tussen haakjes: dezelfde stoffen gescoord als negatief
              Reproduceerbaarheid van testuitslagen
              In hoeverre de stoffen reproduceerbare scores in BB en MM geven is reeds besproken.
              Gezien de verschillen in proefopzet gaat het daarbij om reproduceerbaarheid in de ruim-
              ste zin van het woord. Van reproduceerbaarheid in engere zin spreekt de commissie
              wanneer identiek uitgevoerde proeven dezelfde resultaten te zien geven. Slechts één
              artikel levert hierover informatie.
                    In drie laboratoria is bepaald of dimethylnitrosamine bij BB-muizen en MM geno-
              toxisch is in de lever 22. Na blootstelling van de verschillende groepen dieren kreeg elk
              laboratorium stukjes van hun levers ter analyse. In alledrie de laboratoria waren beide
              tests positief.
28            Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 28 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 29 ======================================================================

<pre>Hoofdstuk 4
          Conclusies en aanbevelingen
          Zijn de nieuwe typen mutageniteitstests met transgene reportergenen bruikbaar bij de
          beoordeling van de genotoxiciteit van chemische stoffen? Uit het literatuuroverzicht in
          hoofdstuk 3 blijkt dat stoffen waarvan vaststaat of ze genotoxische eigenschappen heb-
          ben in voldoende aantallen getest zijn om conclusies te trekken over de bruikbaarheid
          van BB en MM. Het feit dat ze commercieel verkrijgbaar zijn verklaart ongetwijfeld
          voor een belangrijk deel waarom zoveel testuitslagen van stoffen in deze stammen zijn
          gepubliceerd en waarom reviews met risicobeoordeling van stoffen als invalshoek
          vooral op deze dieren zijn gericht.
              Om de bruikbaarheid van de nieuwe tests te beoordelen gaat de commissie eerst in
          op de betrouwbaarheid (paragraaf 4.1). Betrouwbaarheid van de testresultaten is immers
          een belangrijke voorwaarde voor een bruikbare test. Daarna volgt een oordeel over de
          bruikbaarheid (paragraaf 4.2). Vervolgens geeft de commissie aanbevelingen voor
          onderzoek om de bruikbaarheid te verbeteren (paragraaf 4.3). Het hoofdstuk sluit af met
          suggesties voor inpassing in het gangbare toxicologische onderzoek (paragraaf 4.4).
4.1       Betrouwbaarheid
          Algemeen oordeel
          Hoe betrouwbaar zijn de uitkomsten van de nieuwe mutageniteitstests? In totaal zijn de
          resultaten van 64 stoffen, 52 genotoxische en 12 niet-genotoxische, geschikt bevonden
          om hierover te oordelen.
          Conclusies en aanbevelingen                                                             29
</pre>

====================================================================== Einde pagina 29 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 30 ======================================================================

<pre>        De gevoeligheid, specificiteit en positieve voorspellende waarde van de tests blijken
   hoog te zijn (minstens 64 procent). De negatieve voorspellende waarde is aanzienlijk
   lager (minstens 36 procent). Deze testprestaties zijn bemoedigend, zeker gezien de vari-
   atie in de wijze waarop de tests zijn gedaan. Ze geven geen aanleiding aan te nemen dat
   BB en MM door de hoge spontane mutatiefrequentie in het reportergen ongeschikt zijn
   als testsysteem. Het is overigens ook mogelijk dat de goede testprestaties juist het
   gevolg zijn van de variatie in de proefopzet. Deze is immers stofspecifiek.
        De commissie vindt het aantal tests te klein om de waargenomen verschillen in test-
   prestaties tussen BB en MM (of tussen BB-ratten en -muizen) als reëel te beschouwen.
   In theorie zouden de reportergenen ook niet tot verschillen mogen leiden. Mede daarom
   acht de commissie de twee testsystemen vooralsnog even geschikt om genotoxische
   eigenschappen of het ontbreken hiervan aan te tonen.
        De commissie vindt de testprestaties weliswaar goed, maar beschouwt de cijfers als
   voorlopig, met als belangrijkste argument dat de onderzochte stoffen niet representatief
   zijn. Het percentage genotoxische stoffen is namelijk onevenredig hoog. Bovendien zijn
   binnen deze groep sterk genotoxische stoffen oververtegenwoordigd. Dit verklaart voor
   een groot deel de goede testprestaties. Ook is te summier onderzocht in hoeverre posi-
   tieve en negatieve scores kunnen worden herhaald.
   Verklaring voor foutnegatieve en foutpositieve uitslagen
   Verscheidene genotoxische stoffen zijn als negatief uit de test naar voren gekomen en
   verscheidene niet-genotoxische stoffen als positief. De commissie heeft geen aanwijzin-
   gen dat de desbetreffende experimenten niet correct zijn uitgevoerd. Evenmin zijn
   gemiddeld kleinere groepen proefdieren gebruikt dan bij de proeven met de juiste uitsla-
   gen. Daarom legt de commissie de uitkomsten uit als werkelijk verschillend van de
   resultaten die het klassieke genotoxiciteitsonderzoek heeft opgeleverd.
        Een voor de hand liggende verklaring voor de foutnegatieve scores is volgens de
   commissie dat de stoffen de onderzochte organen niet hebben bereikt als gevolg van
   tekortkomingen in de proefopzet. Te denken valt aan bijvoorbeeld te korte blootstelling.
   Of wellicht hebben de stoffen de organen wel bereikt, maar was de expressietijd niet
   optimaal. De geconstateerde foutnegatieve uitslagen zouden dus voor rekening van ver-
   schillen in proefopzet kunnen komen, behalve misschien bij aflatoxine en N-hydroxy-2-
   acetylaminofluoreen. Deze twee verbindingen zijn beide negatief gebleken bij muizen,
   maar hebben positief gescoord in ratten. Van aflatoxine staat vast dat ratten er gevoeli-
   ger voor zijn dan muizen. Of bij N-hydroxy-2-acetylaminofluoreen ook sprake is van
   een dergelijk verschil in gevoeligheid is onbekend.
        Zijn er andere verklaringen mogelijk? Kan het werkingsmechanisme van de geno-
   toxische stoffen de negatieve uitslag in de nieuwe tests verklaren? De commissie meent
30 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 30 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 31 ======================================================================

<pre>van niet, omdat alle genotoxische stoffen, in meer of mindere mate, het vermogen bezit-
ten genmutaties te induceren. In het verleden bestond het beeld dat genotoxische stoffen
óf genmutaties óf chromosoomafwijkingen kunnen veroorzaken. Dit is inmiddels door
de feiten achterhaald. In het algemeen bezitten genotoxische stoffen het vermogen beide
soorten mutaties te veroorzaken, maar in verschillende mate. Daarom is het niet aanne-
melijk dat de negatief scorende genotoxische stoffen op grond van hun werkingsmecha-
nisme door het testsysteem worden gemist.
     De commissie acht het eerder een kwestie van lage gevoeligheid van de testsyste-
men, waardoor genotoxische stoffen die relatief weinig genmutaties induceren negatief
scoren in de test. De resultaten van ENU, MNU, IPMS, EMS en MMS wijzen in deze
richting. Deze stoffen zijn allemaal alkylerende verbindingen, die dezelfde soort DNA-
adducten en dus ook dezelfde genmutaties kunnen veroorzaken 23,24. De eerste drie vor-
men veel van deze mutagene adducten per eenheid DNA, de laatste twee aanzienlijk
minder. Dit tweetal geeft (lang) niet altijd een positieve score in BB en MM, de andere
drie stoffen doen dat wel. Dit kan een aanwijzing zijn dat de test met deze dieren minder
gevoelig is dan het klassieke genotoxiciteitsonderzoek.
     Wat kan een verklaring zijn voor de foutpositieve testuitkomsten? Bij de niet-geno-
toxische stoffen met positieve scores zou het om stoffen kunnen gaan die met de traditi-
onele tests zijn gemist en dus ten onrechte het predikaat niet-genotoxisch hebben
gekregen. Dit is zeker niet denkbeeldig wanneer de doelorganen en de uitslagen van de
traditionele en van de nieuwe tests in ogenschouw worden genomen. Hiervoor heeft de
commissie bovendien een argument van theoretische aard: het feit dat met de nieuwe
testsystemen in vivo genmutaties worden aangetoond, iets wat voorheen niet mogelijk
was. Ook bij sommige stoffen uit de restgroep in bijlage D, waarvan niet vaststaat of ze
genotoxisch zijn, zou een positieve score in deze testsystemen op genotoxiciteit kunnen
wijzen.
Betekenis van afwijkende uitslagen
Het is gebruikelijk om een nieuwe onderzoeksmethode te valideren door de uitkomsten
van onderzoek met methoden die zich reeds hebben bewezen als maatstaf te nemen. De
reden is het ontbreken van een goed alternatief. Daarom berust de validatie van een
nieuwe test doorgaans op vergelijking met ingeburgerde onderzoeksmethoden. In dit
advies is dat het totaal van de andere, ten dele gevalideerde en gestandaardiseerde muta-
geniteitstests en andere types onderzoek, zoals cohortonderzoek naar bijvoorbeeld chro-
mosoomafwijkingen in het perifere bloed als gevolg van blootstelling aan de bewuste
stof. Aan een dergelijke afhankelijkheid valt niet te ontkomen. De afwijkende uitslagen
van de nieuwe tests moeten dan ook in dit licht worden beoordeeld.
Conclusies en aanbevelingen                                                               31
</pre>

====================================================================== Einde pagina 31 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 32 ======================================================================

<pre>         Er zijn twee mogelijke verklaringen voor de afwijkende resultaten: óf het klassieke
   genotoxiciteitsonderzoek heeft een correcte uitkomst gegeven, óf de nieuwe test. Bij de
   foutnegatieve scores denkt de commissie, gezien de bewijskracht voor genotoxiciteit uit
   het traditionele genotoxiciteitsonderzoek, aan een uit proefopzet en proefdier te verkla-
   ren uitslag – en dus aan de eerste verklaring. Bij de foutpositieve ligt het anders. Aange-
   zien het testsysteem op genmutaties in vivo is gericht, dus op een ander eindpunt dan de
   traditionele testsystemen, vindt zij het in die gevallen raadzaam van genotoxiciteit uit te
   gaan. Tot slot merkt zij op dat een incidentele op toeval berustende foute uitslag niet kan
   worden uitgesloten.
         De commissie vindt nader onderzoek wenselijk om beter inzicht te krijgen in de
   gevoeligheid en specificiteit van de testsystemen. Allereerst zijn meer uitslagen nodig
   van niet-genotoxische stoffen, aangezien deze ondervertegenwoordigd zijn. Voor wat
   betreft de genotoxische stoffen is voornamelijk met (zeer) sterke gewerkt. De commissie
   vraagt ook aandacht voor zwak genotoxische stoffen (marginaal positief bevonden met
   klassieke onderzoeksmethoden).
   Verklaring voor slechte score in voortplantingsorganen
   Op basis van de uitslagen van enkele stoffen kan een uitspraak worden gedaan over de
   mogelijkheid om met BB en MM mutageniteit in geslachtscellen te detecteren. Dit zijn
   de eerdergenoemde bewezen geslachtscelmutagenen bij de muis, die allemaal sterk
   genotoxisch zijn. Een hiervan, MMS, heeft desondanks in een reeks experimenten, op
   één keer zwak positief na, negatief gescoord in geslachtscellen van BB-muizen en MM.
   Deze experimenten dekken een range van expressietijden. Dit is belangrijk, want de
   expressietijd bepaalt op welke ontwikkelingsstadia van de zaadcel de stof wordt getest
   25,26
         .
         Het onderzoek vertoont op dit punt geen tekortkomingen: alle stadia zijn onder-
   zocht. De slechte scores zouden te maken kunnen hebben met de stadia waarin MMS
   mutageen werkt. Van deze stof is namelijk bekend dat hij uitsluitend mutageen is in de
   stadia na de meiose of reductiedeling (zie bijvoorbeeld 16,27). Dit is de celdeling waarbij
   het aantal chromosomen tot de helft wordt verminderd. Het bacteriële detectiesysteem
   van BB en MM leent zich niet voor het aantonen van DNA-schade in postmeiotische
   geslachtscellen. Het steunt op verdubbeling van het DNA gevolgd door celdeling.
   Daarom is het bruikbaar voor alle soorten lichaamscellen inclusief premeiotische
   geslachtscellen. Wijzigingen in het DNA van postmeiotische cellen kunnen niet met het
   detectiesysteem van BB en MM worden aangetoond, omdat in dit ontwikkelingsstadium
   geen DNA-verdubbeling – en dus ook geen vorming van een mutatie – plaatsvindt, en
   geen celdeling. Een klassieke test als de specifieke-locustest heeft hiervan geen last,
   want die berust op een ander detectiesysteem: een door mutatie gewijzigde eigenschap
32 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 32 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 33 ======================================================================

<pre>    van de nakomelingen, zoals vachtkleur. In dat geval vinden verdubbeling van het DNA
    en celdeling na de bevruchting plaats, dus in het nageslacht.
         In tegenstelling tot MMS scoort ENU wel positief in alle proeven met BB en MM
    waarbij geslachtscellen zijn geanalyseerd. Van deze stof staat vast dat hij mutageen is in
    pre- én postmeiotische cellen (zie bijvoorbeeld 18,19). Dit is in overeenstemming met de
    zojuist geschetste verklaring van de MMS-resultaten.
    Beperkingen bij de orgaankeuze
    De commissie concludeert dat BB en MM niet kunnen dienen om alle stoffen die muta-
    geen zijn in geslachtscellen te herkennen. Stoffen als MMS die uitsluitend genotoxisch
    zijn in postmeiotische zaadcellen worden er namelijk niet mee gedetecteerd. Volgens de
    commissie zijn alle bekende geslachtscelmutagenen echter ook mutageen gebleken in
    andere celtypes. Mede op grond van overwegingen van theoretische aard acht zij
    daarom elke stof met genotoxische eigenschappen een potentieel geslachtscelmutageen.
         BB en MM kunnen in theorie zonder zulke beperkingen worden ingezet om te bepa-
    len of stoffen mutageen zijn in andere organen dan die van het voortplantingssysteem.
    Voorzover deze aanname proefondervindelijk is getoetst bevestigen de onderzoeksre-
    sultaten de theorie.
4.2 Bruikbaarheid voor risicobeoordeling
    Interpretatie van toekomstige testresultaten
    De testresultaten tot nu toe maken duidelijk dat een positieve score met grote, zij het niet
    met vrijwel 100 procent betrouwbaarheid een genotoxische stof identificeert. De com-
    missie vindt een positieve score dan ook reden om de desbetreffende stof als geno-
    toxisch te beschouwen. Daarbij telt ook het unieke karakter van de testsystemen mee: ze
    detecteren genotoxische stoffen die in vivo genmutaties teweeg kunnen brengen.
         Een negatieve uitslag blijkt met meer onzekerheid omgeven te zijn. Juist deze zal
    men echter willen kunnen aanvoeren als bewijs dat een stof veilig is. Volgens de com-
    missie geven de tests nog te veel foutnegatieve resultaten om een negatieve score als
    bewijs te accepteren voor het ontbreken van genotoxische eigenschappen.
    Bruikbaarheid voor routinematige toepassing
    Op grond van dit oordeel over de betrouwbaarheid meent de commissie dat de testsyste-
    men met reportergenen op dit moment waardevolle informatie kunnen verschaffen.
    Doordat alle organen van BB en MM (met alleen bij de voortplantingsorganen een
    Conclusies en aanbevelingen                                                                  33
</pre>

====================================================================== Einde pagina 33 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 34 ======================================================================

<pre>    beperking) op mutaties kunnen worden onderzocht, kan de proefopzet op de te onder-
    zoeken stof worden toegesneden. Dit vermindert de kans op foutnegatieve uitslagen.
         Voor routinematige toepassing ziet de commissie echter (nog) geen aanleiding. Dat
    zou immers betekenen werken volgens een voorschrift waarin de wijze van uitvoering in
    grote lijnen is vastgelegd. Naar de mening van de commissie is het opstellen van een
    dergelijk protocol op dit moment niet mogelijk. De toekomst zal moeten leren of de tests
    op den duur met voldoende betrouwbaarheid kunnen worden uitgevoerd en volgens
    zo’n standaardvoorschrift, of anders ten minste op minder uiteenlopende wijze dan tot
    nu toe gebeurd is. Om dit doel naderbij te brengen doet de commissie in de volgende
    paragraaf enige suggesties voor de proefopzet.
4.3 Aanbevelingen voor verdere validatie en standaardisatie
    Deelvoorschriften formuleren bij weinig of geen toxicologische informatie
    Als men geen of vrijwel geen toxicologische informatie heeft op basis waarvan beslist
    kan worden hoe de proef het beste kan worden ingericht, is gedeeltelijke overeenkomst
    in de wijze van uitvoering zinvol. Deze situatie leent zich volgens de commissie voor
    deelvoorschriften.
         Evenals bij de reeds gestandaardiseerde testsystemen moet de wijze van toediening
    aan de proefdieren worden afgestemd op de chemische en fysische eigenschappen van
    de te testen stof. Het is niet persé noodzakelijk de stof aan de proefdieren toe te dienen
    via de weg waarlangs de mens met de stof in contact kan komen. Het doel is immers de
    stof in de bloedbaan te brengen om alle organen doeltreffend bloot te stellen. Waterop-
    losbare stoffen kunnen daarom intraveneus worden ingespoten of oraal (door de mond)
    worden toegediend, vetoplosbare verbindingen vergen orale toediening, en voor gassen
    en vluchtige vloeistoffen tenslotte is inhalatie (inademing) nodig.
         Aangezien het ondoenlijk is alle organen op mutaties te onderzoeken, is een proef
    van beperkte omvang de aangewezen optie. De commissie vindt analyse van drie orga-
    nen een verantwoord compromis tussen haalbaarheid en de kans om genotoxiciteit te
    detecteren. Selectiecriteria zijn de mate van blootstelling en het vermogen tot celdeling.
    De commissie stelt voor in ieder geval lever en beenmerg te analyseren. Welk orgaan als
    derde in aanmerking komt voor onderzoek, hangt af van de wijze waarop de te testen
    stof wordt toegediend.
         De lever is geschikt, omdat het een goed doorbloed orgaan is. Die goede doorbloe-
    ding bevordert het contact met de toegediende stof en dus het eventuele ontstaan van
    DNA-schade. Bovendien zet de lever veel stoffen om in metabolieten. Dit is voor het
    testen van belang, want sommige stoffen zijn zelf niet genotoxisch, maar kunnen in de
    lever worden omgezet in genotoxische metabolieten. In dergelijke gevallen is de lever
34  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 34 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 35 ======================================================================

<pre>het meest aan de metabolieten blootgestelde orgaan. Nadelig is wel dat de lever weinig
celdeling kent. Bij orale blootstelling is er nog een extra reden waarom de lever zich
goed voor bestudering leent. Als een stof eenmaal vanuit het maagdarmkanaal in het
lichaam is opgenomen, wordt hij eerst door de bloedsomloop naar de lever vervoerd.
Pas na passage van dit orgaan wordt hij dan verder door het lichaam verspreid. Dit werkt
blootstelling van de lever in de hand.
     Beenmerg is het tweede weefsel dat de commissie relevant vindt. Het bevat snelde-
lende cellen en heeft daardoor een grote gevoeligheid. Het feit dat lever en beenmerg
doelorgaan zijn bij andere in vivo tests vindt de commissie geen bezwaar. Ten eerste
heeft de test een ander eindpunt (genmutaties). Verder zou kunnen blijken dat hij gevoe-
liger is. Dit laatste lijkt misschien strijdig met de eerder gegeven verklaringen voor de
foutnegatieve testuitslagen. De test is daar echter vergeleken met het klassieke genotoxi-
citeitsonderzoek in totaal, hier wordt hij dat met een individuele test.
     Bij orale toediening en injectie is de darm het derde orgaan dat voor analyse in aan-
merking komt, omdat het darmepitheel snel deelt. In geval van orale toediening komt
hier nog de extra goede blootstelling van het maagdarmkanaal bovenop.
     Bij een inhalatieproef zou de analyse naast lever en beenmerg op de longen moeten
worden gericht.
     Blootstelling via de huid (dermaal) ontbreekt hier, omdat de hierboven genoemde
toedieningswegen effectiever zijn voor het blootstellen van inwendige organen.
Mogelijkheden voor maatwerk benutten
Indien er gegevens zijn die daarvoor aanknopingspunten bieden, kan de opzet van de
proef beter op de te onderzoeken stof afgestemd worden. Dan is er dus aanleiding om
van het zojuist geschetste, ten dele vastgelegde voorschrift af te wijken. Zo kan uit gege-
vens over de verdeling van de stof en zijn metabolieten over het lichaam blijken dat
beter andere dan de bovengenoemde organen kunnen worden onderzocht. Ook kan de
wijze van toediening worden veranderd: bij (vermoedens van) dermale blootstelling of
effecten kan de huid aan de stof worden blootgesteld en op genotoxiciteit worden onder-
zocht.
     Naast vrijheid van orgaankeuze hebben de testsystemen nog enkele andere moge-
lijkheden voor maatwerk te bieden. Bijzonder is de mogelijkheid te kiezen tussen rat en
muis. Dit is bijvoorbeeld van belang als er forse verschillen in gevoeligheid voor de te
testen stof zijn, zoals bij aflatoxine. Men kan dan de gevoeligste van de twee nemen.
Een dergelijke aanpak sluit goed aan bij het Gezondheidsraadadvies ‘Onderzoek
gezondheidsrisico’s stoffen: een gerichtere benadering’, waarin betere aansluiting van
het onderzoek wordt bepleit bij het gebruik van de stof en het daarmee verbonden bloot-
stellingsprofiel 28.
Conclusies en aanbevelingen                                                                 35
</pre>

====================================================================== Einde pagina 35 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 36 ======================================================================

<pre>         Het maatwerk kan zelfs nog een stap verder gaan. BB en MM dragen, net als nor-
    male, niet genetisch gemodificeerde dieren in alle lichaamscellen het HPRT-gen. Hier-
    door kunnen de sterke punten van endogene en transgene reportersystemen worden
    gecombineerd in één test.
    Streven naar standaardisatie
    Behalve de voorgestelde combinaties van blootstellingsroutes en op genmutaties te
    onderzoeken organen zijn er nog verscheidene andere aspecten van de test die zich lenen
    voor (enige mate van) standaardisatie. Aangezien groepsgrootte en proefopzet een veel
    groter effect op de uitkomst hebben dan de uiteindelijke weefselanalyse, verdient het
    aanbeveling de inspanningen daarop te richten 25. Bij standaardisatie van de proefopzet
    valt te denken aan de duur van de proef, het blootstellingsschema en de statistische ana-
    lyse. Weefsels verschillen in delingssnelheid en als gevolg hiervan in het optimale tijd-
    stip voor analyse 29. Bovendien verschillen stoffen in hun kinetiek. Diverse publicaties
    bevatten suggesties voor standaardisatie 11,13,29,30. De commissie beveelt aan voorschrif-
    ten in OESO-verband te laten opstellen.
    Geharmoniseerde validatie
    Voor de verdere validatie van de test beveelt de commissie de algemene uitgangspunten
    voor de wetenschappelijke validatie van testmethoden aan die de OESO inmiddels in
    concept gereed heeft 31.
4.4 Aanbevelingen voor inpassing in de gangbare teststrategie
    De in vivo test met een transgeen reportergen kan goed worden ingepast in het onder-
    zoek op genotoxiciteit dat de EU tegenwoordig voorschrijft. De EU verlangt van de pro-
    ducent of degene die de stof voor commerciële doeleinden gebruikt of in de handel
    brengt een dossier met standaard toxicologische gegevens. Bij het onderdeel genotoxici-
    teit worden de resultaten van stapsgewijs uitgevoerde in vitro en in vivo tests gevraagd:
    bij elke stap bepalen de resultaten hoe de volgende stap er uit moet zien. Uitzonderingen
    daargelaten moeten in vitro tests en zonodig daarna in vivo tests gedaan worden. Welke
    genotoxiciteitstests in de verschillende stappen toegestaan of verplicht zijn, wordt
    bepaald door het productievolume en de toepassing van de stof. Er is aparte regelgeving
    voor allerlei categorieën stoffen, bestemd voor de eindverbruiker (bijvoorbeeld genees-
    middelen en gewasbeschermingsmiddelen) of niet (bijvoorbeeld de zogenoemde
    bestaande stoffen, die op een speciale lijst staan).
36  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 36 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 37 ======================================================================

<pre>     Ondanks de variatie in teststrategie vindt de commissie toepassing van de nieuwe
testsystemen voor al deze beleidsterreinen het overwegen waard. Op enkele van deze
terreinen – bij onder meer de bovengenoemde ‘bestaande stoffen’ – is een test hiermee
reeds toegestaan, mits er sprake is van een goed gemotiveerde proefopzet. Voor de ove-
rige terreinen beveelt de commissie aan de test met dezelfde randvoorwaarden toe te
laten.
     De testsystemen zijn vooral van betekenis als er bevindingen over een stof zijn uit
gestandaardiseerde genotoxiciteitstests die elkaar tegenspreken. Deze situatie doet zich
bijvoorbeeld voor wanneer de bewuste stof positief is gebleken in een in vitro test op
genmutaties, maar negatief heeft gescoord in in vivo tests voor UDS en chromosoomaf-
wijkingen. Dankzij de nieuwe testsystemen kan dan ook in vivo bestudeerd worden of
de stof in staat is genmutaties te geven, iets wat voorheen niet mogelijk was.
     De in vivo test voor genmutaties vormt dus een waardevol element voor de huidige
teststrategie. In verhouding tot de ingeburgerde tests is hij echter bewerkelijk en tijdro-
vend. Bovendien ontbreekt standaardisatie, een belangrijke voorwaarde voor validatie.
Daarom vindt de commissie de test voorlopig alleen in aanmerking komen voor ad hoc
aanvulling op de gangbare tests, zoals die voor UDS en chromosoomafwijkingen in het
hierboven gegeven voorbeeld.
Conclusies en aanbevelingen                                                                 37
</pre>

====================================================================== Einde pagina 37 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 38 ======================================================================

<pre>38 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 38 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 39 ======================================================================

<pre>Liter
      Literatuur
1     Europese Raad. Richtlijn 67/548/EEG betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke
      bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen. Publicatieblad van
      de Europese Gemeenschappen 1967; 196: 1
2     Gezondheidsraad. Betekenis van mutageniteitstests. Den Haag: Gezondheidsraad; 1995: Publicatie nr 1995/
      20.
3     Gezondheidsraad. Beoordeling carcinogeniteit van stoffen. Den Haag: Gezondheidsraad; 1996: Publicatie
      nr 1996/26.
4     International Programme on Chemical Safety. Descriptons of selected key generic terms used in chemical
      hazard/risk assessment. Genève: WHO; 2004. Internet: www.who.int/ipcs .
5     Verenigde Naties. The Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS).
      New York en Genève: Verenigde Naties; 2003. Internet: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/
      ghs.html .
6     European Commission. Technical Guidance Document on Risk Assessment in support of Commission
      Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No
      1488/94 on Risk Assessment for existing substances, Directive 98/8/EC of the European Parliament and of
      the Council concerning the placing of biocidal products on the market. Part I. Ispra: European Commission
      Joint Research Centre: European Chemicals Bureau; 2003. Internet: http://ecb.jrc.it .
7     Europese Raad. Richtlijn van de Raad van 27 juli 1976 betreffende de onderlinge aanpassing van de
      wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen der Lidstaten inzake de beperking van het op de markt brengen
      en van het gebruik van bepaalde gevaarlijke stoffen en preparaten. Publicatieblad van de Europese Unie
      1976; L 262: 201
      Literatuur                                                                                                 39
</pre>

====================================================================== Einde pagina 39 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 40 ======================================================================

<pre>8  Willems MI, van Benthem J. Mutagenicity of chemicals in genetically modified animals. Bilthoven: RIVM;
   2000: RIVM report 650210002; TNO report V99.1097.
9  Malling HV, Delongchamp RR. Direct separation of in vivo and in vitro am3 revertants in transgenic mice
   carrying the phiX174 am3, cs70 vector. Environ Mol Mutagen 2001; 37(4): 345-355
10 Weaver RP, Malling HV. The in vivo but not the in vitro am3 revertant frequencies increase linearly with
   increased ethylnitrosourea doses in spleen of mice transgenic for phiX174 am3, cs70 using the single burst
   assay. Mutat Res 2003; 534(1-2): 1-13
11 Gorelick NJ. Overview of mutation assays in transgenic mice for routine testing. Environmental and
   Molecular Mutagenesis 1995; 25: 218-30
12 Schmezer P, Eckert C. Induction of mutations in transgenic animal models: BigBlue™ and Muta™Mouse.
   In: McGregor DB, Rice JM, Venitt S, editors. The use of short- and medium-term tests for carcinogens and
   data on genetic effects in carcinogenic hazard evaluation. Lyon: International Agency for Research on
   Cancer; 1999: 367-94.
13 Thybaud V, Dean S, Nohmi T, de Boer J, Douglas GR, Glickman BW et al. In vivo transgenic mutation
   assays. Mutat Res 2003; 540(2): 141-151
14 Ehling UH, Doherty DG, Malling HV. Differential spermatogenic response of mice to the induction of
   dominant-lethal mutations by n-propyl methanesulfonate and isopropyl methanesulfonate. Mutat Res 1972;
   15(2): 175-184
15 Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus mutations in male mice by ethyl
   methanesulfonate (EMS). Mutat Res 1989; 227(2): 91-95
16 Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus and dominant lethal mutations in male mice in
   the low dose range by methyl methanesulfonate (MMS). Mutat Res 1990; 230(1): 61-70
17 Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus and dominant lethal mutations in male mice by
   1-methyl-1-nitrosourea (MNU). Mutat Res 1991; 250(1-2): 447-456
18 Favor J, Sund M, Neuhauser-Klaus A, Ehling UH. A dose-response analysis of ethylnitrosourea-induced
   recessive specific-locus mutations in treated spermatogonia of the mouse. Mutat Res 1990; 231(1): 47-54
19 Favor J, Neuhauser-Klaus A, Ehling UH. The frequency of dominant cataract and recessive specific-locus
   mutations and mutation mosaics in F1 mice derived from post-spermatogonial treatment with
   ethylnitrosourea. Mutat Res 1990; 229(2): 105-114
20 Generoso WM, Cain KT, Krishna M, Huff SW. Genetic lesions induced by chemicals in spermatozoa and
   spermatids of mice are repaired in the egg. Proc Natl Acad Sci U S A 1979; 76(1): 435-437
21 Katoh M, Iwahara S. Relationship between chromosome aberrations at the first cleavage metaphases and
   postimplantation loss in dominant lethal mutations induced by isopropyl methanesulfonate. Jpn J Genet
   1983; 58: 345-351
22 Tinwell H, Liegibel U, Krebs O, Schmezer P, Favor J, Ashby J. Comparison of lacI and lacZ transgenic
   mouse mutation assays: an EU-sponsored interlaboratory study. Mutat Res 1995; 335(2): 185-190
23 Beranek DT, Weis CC, Swenson DH. A comprehensive quantitative analysis of methylated and ethylated
   DNA using high pressure liquid chromatography. Carcinogenesis 1980; 1(7): 595-606
40 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 40 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 41 ======================================================================

<pre>24 van Zeeland AA. Molecular dosimetry of alkylating agents: quantitative comparison of genetic effects on
   the basis of DNA adduct formation. Mutagenesis 1988; 3(3): 179-191
25 Ashby J, Gorelick NJ, Shelby MD. Mutation assays in male germ cells from transgenic mice: overview of
   study and conclusions. Mutation Research 1997; 388 (2-3): 111-22
26 Katoh M, Inomata T, Horiya N, Suzuki F, Shida T, Ishioka K et al. Studies on mutations in male germ cells
   of transgenic mice following exposure to isopropyl methanesulfonate, ethylnitrosourea or X-ray. Mutat Res
   1994; 341(1): 17-28
27 Shelby MD, Tindall KR. Mammalian germ cell mutagenicity of ENU, IPMS and MMS, chemicals selected
   for a transgenic mouse collaborative study. Mutat Res 1997; 388(2-3): 99-109
28 Gezondheidsraad. Onderzoek gezondheidsrisico's stoffen: een gerichtere benadering. Den Haag:
   Gezondheidsraad; 2001: Publicatie nr 2001/24.
29 Heddle JA, Martus HJ, Douglas GR. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays.
   Environmental and Molecular Mutagenesis 2003; 41: 1-6
30 Heddle JA, Dean S, Nohmi T, Boerrigter M, Casciano D, Douglas GR et al. In vivo transgenic mutation
   assays. Environmental and Molecular Mutagenesis 2000; 35: 253-59
31 OECD. Draft guidance document on the validation and international acceptance of new or updated test
   methods for hazard assessment. Parijs: Organisation for Economic Co-operation and Development,
   Environment Directorate; 2003: OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and
   Assessment No. 34.
32 Brooks TM, Szegedi M, Rosher P, Dean SW. The detection of gene mutation in transgenic mice (Muta
   Mouse) following a single oral dose of 2-acetylaminofluorene. Mutagenesis 1995; 10(2): 149-150
33 Gunz D, Shephard SE, Lutz WK. Can nongenotoxic carcinogens be detected with the lacI transgenic mouse
   mutation assay? Environ Mol Mutagen 1993; 21(3): 209-211
34 Shephard SE, Sengstag C, Lutz WK, Schlatter C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue)
   following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res 1993; 302(2): 91-96
35 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Relative activities of methyl methanesulphonate (MMS) as a genotoxin,
   clastogen and gene mutagen to the liver and bone marrow of MutaMouse mice. Environ Mol Mutagen 1998;
   32(2): 163-172
36 Health Council of the Netherlands. Acrylamide; Evaluation of the carcinogenicity and genotoxicity. The
   Hague: Health Council of the Netherlands; 2002: publication no 2002/02OSH.
37 Hoorn AJ, Custer LL, Myhr BC, Brusick D, Gossen J, Vijg J. Detection of chemical mutagens using Muta
   Mouse: a transgenic mouse model. Mutagenesis 1993; 8(1): 7-10
38 Krebs O, Favor J. Somatic and germ cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
   acrylamide or ethylnitrosourea. Mutat Res 1997; 388(2-3): 239-248
39 Myhr BC. Validation studies with Muta Mouse: a transgenic mouse model for detecting mutations in vivo.
   Environ Mol Mutagen 1991; 18(4): 308-315
40 Monroe TJ, Mitchell MA. In vivo mutagenesis induced by CC-1065 and adozelesin DNA alkylation in a
   transgenic mouse model. Cancer Res 1993; 53(23): 5690-5696
   Literatuur                                                                                                41
</pre>

====================================================================== Einde pagina 41 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 42 ======================================================================

<pre>41 Dutch Expert Committee on Occupational Standards. Scientific documentation on the Dutch list of
   occupational carcinogens I. Den Haag: SDU; 1995: report nr RA 1/95.
42 Autrup H, Jorgensen EC, Jensen O. Aflatoxin B1 induced lacI mutation in liver and kidney of transgenic
   mice C57BL/6N: effect of phorone. Mutagenesis 1996; 11(1): 69-73
43 Davies R, Oreffo VI, Martin EA, Festing MF, White IN, Smith LL et al. Tamoxifen causes gene mutations
   in the livers of lambda/lacI transgenic rats. Cancer Res 1997; 57(7): 1288-1293
44 Davies R, Gant TW, Smith LL, Styles JA. Tamoxifen induces G:C-->T:A mutations in the cII gene in the
   liver of lambda/lacI transgenic rats but not at 5'-CpG-3' dinucleotide sequences as found in the lacI
   transgene. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1351-1356
45 Dycaico MJ, Stuart GR, Tobal GM, de Boer JG, Glickman BW, Provost GS. Species-specific differences in
   hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following
   exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis 1996; 17(11): 2347-2356
46 Ohsawa K, Hirano N, Sugiura M, Nakagawa S, Kimura M. Genotoxicity of o-aminoazotoluene (AAT)
   determined by the Ames test, the in vitro chromosomal aberration test, and the transgenic mouse gene
   mutation assay. Mutat Res 2000; 471(1-2): 113-126
47 Fletcher K, Tinwell H, Ashby J. Mutagenicity of the human bladder carcinogen 4-aminobiphenyl to the
   bladder of MutaMouse transgenic mice. Mutat Res 1998; 400(1-2): 245-250
48 Turner SD, Tinwell H, Piegorsch W, Schmezer P, Ashby J. The male rat carcinogens limonene and sodium
   saccharin are not mutagenic to male Big Blue rats. Mutagenesis 2001; 16(4): 329-332
49 Ochiai M, Ishida K, Ushijima T, Suzuki T, Sofuni T, Sugimura T et al. DNA adduct level induced by 2-
   amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]-quinoline in Big Blue mice does not correlate with mutagenicity.
   Mutagenesis 1998; 13(4): 381-384
50 Suzuki T, Hayashi M, Ochiai M, Wakabayashi K, Ushijima T, Sugimura T et al. Organ variation in the
   mutagenicity of MeIQ in Big Blue lacI transgenic mice. Mutat Res 1996; 369(1-2): 45-49
51 Davis CD, Dacquel EJ, Schut HA, Thorgeirsson SS, Snyderwine EG. In vivo mutagenicity and DNA adduct
   levels of heterocyclic amines in Muta mice and c-myc/lacZ double transgenic mice. Mutat Res 1996;
   356(2): 287-296
52 Itoh T, Suzuki T, Nishikawa A, Furukawa F, Takahashi M, Xue W et al. In vivo genotoxicity of 2-amino-
   3,8-dimethylimidazo[4, 5-f]quinoxaline in lacI transgenic (Big Blue) mice. Mutat Res 2000; 468(1): 19-25
53 Thorgeirsson SS, Ryu DY, Weidner V, Snyderwine EG. Carcinogenicity and mutagenicity of heterocyclic
   amines in transgenic mouse models. Cancer Lett 1999; 143(2): 245-247
54 Bol SA, Horlbeck J, Markovic J, de Boer JG, Turesky RJ, Constable A. Mutational analysis of the liver,
   colon and kidney of Big Blue rats treated with 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline. Carcinogenesis
   2000; 21(1): 1-6
55 Lynch AM, Gooderham NJ, Boobis AR. Organ distinctive mutagenicity in MutaMouse after short-term
   exposure to PhIP. Mutagenesis 1996; 11(5): 505-509
56 Okonogi H, Stuart GR, Okochi E, Ushijima T, Sugimura T, Glickman BW et al. Effects of gender and
   species on spectra of mutation induced by 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in the lacI
   transgene. Mutat Res 1997; 395(2-3): 93-99
42 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 42 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 43 ======================================================================

<pre>57 Stuart GR, Holcroft J, de Boer JG, Glickman BW. Prostate mutations in rats induced by the suspected
   human carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine. Cancer Res 2000; 60(2): 266-268
58 Stuart GR, de Boer JG, Haesevoets R, Holcroft J, Kangas J, Sojonky K et al. Mutations induced by 2-
   amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4,5-b]pyridine (PhIP) in cecum and proximal and distal colon of lacI
   transgenic rats. Mutagenesis 2001; 16(5): 431-437
59 Yang H, Stuart GR, Glickman BW, de Boer JG. Modulation of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-
   b]pyridine-induced mutation in the cecum and colon of big blue rats by conjugated linoleic acid and 1,2-
   dithiole-3-thione. Nutr Cancer 2001; 39(2): 259-266
60 Yang H, Holcroft J, Glickman BW, de Boer JG. Conjugated linoleic acid inhibits mutagenesis by 2-amino-
   1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in the prostate of Big Blue rats. Mutagenesis 2003; 18(2): 195-
   200
61 Zhang S, Lloyd R, Bowden G, Glickman BW, de Boer JG. Msh2 DNA mismatch repair gene deficiency and
   the food-borne mutagen 2-amino-1-methy1-6-phenolimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) synergistically affect
   mutagenesis in mouse colon. Oncogene 2001; 20(42): 6066-6072
62 Gezondheidsraad: Commissie Risico-evaluatie van stoffen. Arseen. Toetsing van een basisdocument. Den
   Haag: Gezondheidsraad; 1993: publicatie nr 1993/02.
63 Noda Y, Suzuki T, Kohara A, Hasegawa A, Yotsuyanagi T, Hayashi M et al. In vivo genotoxicity
   evaluation of dimethylarsinic acid in MutaMouse. Mutat Res 2002; 513(1-2): 205-212
64 Gezondheidsraad, Commissie Beoordeling carcinogeniteit van stoffen. Benzeen. Rijswijk:
   Gezondheidsraad; 1997: publicatie no 1997/29.
65 Provost GS, Mirsalis JC, Rogers BJ, Short JM. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-
   phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation
   analysis. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 342-347
66 Gezondheidsraad. Polycyclische aromatische koolwaterstoffen; toetsing van een basisdocument. Den Haag:
   Gezondheidsraad; 1990: publicatie nr 1990/23.
67 Dean SW, Coates A, Brooks TM, Burlinson B. Benzo[a]pyrene site of contact mutagenicity in skin of Muta
   Mouse. Mutagenesis 1998; 13(5): 515-518
68 Hakura A, Tsutsui Y, Sonoda J, Kai J, Imade T, Shimada M et al. Comparison between in vivo mutagenicity
   and carcinogenicity in multiple organs by benzo[a]pyrene in the lacZ transgenic mouse (Muta Mouse).
   Mutat Res 1998; 398(1-2): 123-130
69 Kohler SW, Provost GS, Fieck A, Kretz PL, Bullock WO, Sorge JA et al. Spectra of spontaneous and
   mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88(18):
   7958-7962
70 Kohler SW, Provost GS, Fieck A, Kretz PL, Bullock WO, Putman DL et al. Analysis of spontaneous and
   induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ Mol Mutagen 1991;
   18(4): 316-321
71 Loli P, Topinka J, Georgiadis P, Dusinska M, Hurbankova M, Kovacikova Z et al. Benzo[a]pyrene-
   enhanced mutagenesis by asbestos in the lung of lambda-lacI transgenic rats. Mutat Res 2004; 553(1-2): 79-
   90
   Literatuur                                                                                                 43
</pre>

====================================================================== Einde pagina 43 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 44 ======================================================================

<pre>72 Skopek TR, Kort KL, Marino DR, Mittal LV, Umbenhauer DR, Laws GM et al. Mutagenic response of the
   endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol
   Mutagen 1996; 28(4): 376-384
73 Recio L, Osterman-Golkar S, Csanady GA, Turner MJ, Myhr B, Moss O et al. Determination of
   mutagenicity in tissues of transgenic mice following exposure to 1,3-butadiene and N-ethyl-N-nitrosourea.
   Toxicol Appl Pharmacol 1992; 117(1): 58-64
74 Recio L, Bond JA, Pluta LJ, Sisk SC. Use of transgenic mice for assessing the mutagenicity of 1,3-
   butadiene in vivo. IARC Sci Publ 1993;(127): 235-243
75 Recio L, Meyer KG, Pluta LJ, Moss OR, Saranko CJ. Assessment of 1,3-butadiene mutagenicity in the bone
   marrow of B6C3F1 lacI transgenic mice (Big Blue): a review of mutational spectrum and lacI mutant
   frequency after a 5-day 625 ppm 1,3-butadiene exposure. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 424-429
76 Sisk SC, Pluta LJ, Bond JA, Recio L. Molecular analysis of lacI mutants from bone marrow of B6C3F1
   transgenic mice following inhalation exposure to 1,3-butadiene. Carcinogenesis 1994; 15(3): 471-477
77 Staedtler F, Crespo-Perez J, Sagelsdorff P, Steiner S, Suter W. 4-chloro-o-phenylenediamine induces a
   dose-related increase in G:C > T:A transversions and one major DNA adduct in the liver of Big Blue mice
   after 26 weeks in feed treatment. Mutat Res 1999; 430(1): 121-130
78 Suter W, Ahiabor R, Blanco B, Locher F, Mantovani F, Robinson M et al. Evaluation of the in vivo
   genotoxic potential of three carcinogenic aromatic amines using the Big Blue transgenic mouse mutation
   assay. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 354-362
79 Suter W, Staedtler F, Poetter-Locher F, Swingler T, Wilson L. 4-Chloro-o-phenylenediamine: a 26-week
   oral (in feed) mutagenicity study in Big Blue mice. Mutat Res 1998; 414(1-3): 149-156
80 Gezondheidsraad. Chroom; Toetsing van een basisdocument. Rijswijk: Gezondheidsraad; 1991: publicatie
   nr 1991/03.
81 Itoh S, Shimada H. Clastogenicity and mutagenicity of hexavalent chromium in lacZ transgenic mice.
   Toxicol Lett 1997; 91(3): 229-233
82 Itoh S, Shimada H. Bone marrow and liver mutagenesis in lacZ transgenic mice treated with hexavalent
   chromium. Mutat Res 1998; 412(1): 63-67
83 Cheng L, Sonntag DM, de Boer J, Dixon K. Chromium(VI)-induced mutagenesis in the lungs of big blue
   transgenic mice. J Environ Pathol Toxicol Oncol 2000; 19(3): 239-249
84 Dutch Expert Committee on Occupational Standards. Scientific documentation on the Dutch list of
   occupational carcinogens II. Den Haag: Sdu; 1995: report nr RA 2/95.
85 Louro H, Silva MJ, Boavida MG. Mutagenic activity of cisplatin in the lacZ plasmid-based transgenic
   mouse model. Environ Mol Mutagen 2002; 40(4): 283-291
86 Gorelick NJ, Andrews JL, deBoer JG, Young R, Gibson DP, Walker VE. Tissue-specific mutant
   frequencies and mutational spectra in cyclophosphamide-treated lacI transgenic mice. Environ Mol
   Mutagen 1999; 34(2-3): 154-166
87 Hoyes KP, Wadeson PJ, Sharma HL, Hendry JH, Morris ID. Mutation studies in lacI transgenic mice after
   exposure to radiation or cyclophosphamide. Mutagenesis 1998; 13(6): 607-612
44 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 44 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 45 ======================================================================

<pre>88  Walker VE, Andrews JL, Upton PB, Skopek TR, deBoer JG, Walker DM et al. Detection of
    cyclophosphamide-induced mutations at the Hprt but not the lacI locus in splenic lymphocytes of exposed
    mice. Environ Mol Mutagen 1999; 34(2-3): 167-181
89  Krebs O, Schafer B, Wolff T, Oesterle D, Deml E, Sund M et al. The DNA damaging drug cyproterone
    acetate causes gene mutations and induces glutathione-S-transferase P in the liver of female Big Blue
    transgenic F344 rats. Carcinogenesis 1998; 19(2): 241-245
90  Cunningham ML, Hayward JJ, Shane BS, Tindall KR. Distinction of mutagenic carcinogens from a
    mutagenic noncarcinogen in the big blue transgenic mouse. Environ Health Perspect 1996; 104 Suppl 3:
    683-686
91  Hayward JJ, Shane BS, Tindall KR, Cunningham ML. Differential in vivo mutagenicity of the carcinogen/
    non-carcinogen pair 2,4- and 2,6-diaminotoluene. Carcinogenesis 1995; 16(10): 2429-2433
92  Mientjes EJ, Luiten-Schuite A, van der WE, Borsboom Y, Bergmans A, Berends F et al. DNA adducts,
    mutant frequencies, and mutation spectra in various organs of lambda lacZ mice exposed to ethylating
    agents. Environ Mol Mutagen 1998; 31(1): 18-31
93  Okada N, Honda A, Kawabata M, Yajima N. Sodium phenobarbital-enhanced mutation frequency in the
    liver DNA of lacZ transgenic mice treated with diethylnitrosamine. Mutagenesis 1997; 12(3): 179-184
94  Suzuki T, Hayashi M, Sofuni T. Initial experiences and future directions for transgenic mouse mutation
    assays. Mutat Res 1994; 307(2): 489-494
95  Suzuki T, Itoh T, Hayashi M, Nishikawa Y, Ikezaki S, Furukawa F et al. Organ variation in the
    mutagenicity of dimethylnitrosamine in Big Blue mice. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 348-353
96  Health Council of the Netherlands: Dutch Expert Committee on Occupational Standards (DECOS). N-
    Nitrosodimethylamine. The Hague: Health Council of the Netherlands; 1999: publication no. 1999/12OSH.
97  Ashby J, Short JM, Jones NJ, Lefevre PA, Provost GS, Rogers BJ et al. Mutagenicity of o-anisidine to the
    bladder of lacI- transgenic B6C3F1 mice: absence of 14C or 32P bladder DNA adduction. Carcinogenesis
    1994; 15(10): 2291-2296
98  Mirsalis JC, Hamer JD, O'Loughlin KG, 'Winegar RA, Short JM. Effects of nongenotoxic carcinogens on
    hepatic mutations in lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1993; 21 (suppl 22): 48
99  Mirsalis JC, Provost GS, Matthews CD, Hamner RT, Schindler JE, O'Loughlin KG et al. Induction of
    hepatic mutations in lacI transgenic mice. Mutagenesis 1993; 8(3): 265-271
100 Schmezer P, Eckert C, Liegibel UM, Klein RG, Bartsch H. Use of Transgenic Mutational Test Systems in
    Risk Assessment of Carcinogens. Arch Toxicol 1998; 20: 321-30
101 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Response of the Muta mouse lacZ/galE- transgenic mutation assay to
    DMN: comparisons with the corresponding Big Blue (lacI) responses. Mutat Res 1994; 307(1): 169-173
102 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Mutation studies with dimethyl nitrosamine in young and old lac I
    transgenic mice. Mutat Res 1994; 307(2): 501-508
103 Shane BS, deBoer JG, Glickman BW, Cunningham ML. Oxazepam is mutagenic in vivo in Big Blue
    transgenic mice. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1315-1321
    Literatuur                                                                                               45
</pre>

====================================================================== Einde pagina 45 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 46 ======================================================================

<pre>104 Shephard SE, Lutz WK, Schlatter C. The lacI transgenic mouse mutagenicity assay: quantitative evaluation
    in comparison to tests for carcinogenicity and cytogenetic damage in vivo. Mutat Res 1994; 306(2): 119-
    128
105 Shephard SE, Gunz D, Schlatter C. Genotoxicity of agaritine in the lacI transgenic mouse mutation assay:
    evaluation of the health risk of mushroom consumption. Food Chem Toxicol 1995; 33(4): 257-264
106 Suzuki T, Miyata Y, Saeki K, Kawazoe Y, Hayashi M, Sofuni T. In vivo mutagenesis by the
    hepatocarcinogen quinoline in the lacZ transgenic mouse: evidence for its in vivo genotoxicity. Mutat Res
    1998; 412(2): 161-166
107 Lefevre PA, Tinwell H, Ashby J. Mutagenicity of the potent rat hepatocarcinogen 6BT to the liver of
    transgenic (lacI) rats: consideration of a reduced mutation assay protocol. Mutagenesis 1997; 12(1): 45-47
108 Ashby J, Brusick D, Myhr BC, Jones NJ, Parry JM, Nesnow S et al. Correlation of carcinogenic potency
    with mouse-skin 32P-postlabeling and Muta-RMouse lac Z- mutation data for DMBA and its K-region
    sulphur isostere: comparison with activities observed in standard genotoxicity assays. Mutat Res 1993;
    292(1): 25-40
109 Brooks TM, Dean SW. Detection of gene mutation in skin, stomach and liver of MutaMouse following oral
    or topical treatment with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or 1-chloromethylpyrene: some
    preliminary observations. Mutagenesis 1996; 11(5): 529-532
110 Hachiya N, Yajima N, Hatakeyama S, Yuno K, Okada N, Umeda Y et al. Induction of lacZ mutation by
    7,12-dimethylbenz[a]anthracene in various tissues of transgenic mice. Mutat Res 1999; 444(2): 283-295
111 Gorelick NJ, Andrews JL, Gu M, Glickman BW. Mutational spectra in the lacl gene in skin from 7,12-
    dimethylbenz[a]anthracene-treated and untreated transgenic mice. Mol Carcinog 1995; 14(1): 53-62
112 Tombolan F, Renault D, Brault D, Guffroy M, Perin-Roussel O, Perin F et al. Kinetics of induction of DNA
    adducts, cell proliferation and gene mutations in the liver of MutaMice treated with 5,9-
    dimethyldibenzo[c,g]carbazole. Carcinogenesis 1999; 20(1): 125-132
113 Tombolan F, Renault D, Brault D, Guffroy M, Perin F, Thybaud V. Effect of mitogenic or regenerative cell
    proliferation on lacz mutant frequency in the liver of MutaTMMice treated with 5, 9-
    dimethyldibenzo[c,g]carbazole. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1357-1362
114 Gezondheidsraad. Ethyleenoxide en styreen; toetsing van criteriadocumenten. Rijswijk: Gezondheidsraad;
    1986: publicatie nr 1986/17.
115 Sisk SC. Determination of circulating micronuclei and mutant frequency in lung, spleen, and germ cells of
    male B6C3F1 LacI transgenic mice after inhalation exposure to ethylene oxide (EtO). Environ Mol
    Mutagen 1994; 23 (suppl 23): 62
116 Sisk SC, Pluta LJ, Meyer KG, Wong BC, Recio L. Assessment of the in vivo mutagenicity of ethylene
    oxide in the tissues of B6C3F1 lacI transgenic mice following inhalation exposure. Mutat Res 1997; 391(3):
    153-164
117 van Delft JH, Bergmans A, Baan RA. Germ-cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
    ethylating and methylating agents: comparison with specific-locus test. Mutat Res 1997; 388(2-3): 165-173
46  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 46 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 47 ======================================================================

<pre>118 van Delft JH, Bergmans A, van Dam FJ, Tates AD, Howard L, Winton DJ et al. Gene-mutation assays in
    lambda lacZ transgenic mice: comparison of lacZ with endogenous genes in splenocytes and small intestinal
    epithelium. Mutat Res 1998; 415(1-2): 85-96
119 Suzuki T, Hayashi M, Wang X, Yamamoto K, Ono T, Myhr BC et al. A comparison of the genotoxicity of
    ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta Mouse). Mutat Res 1997;
    395(1): 75-82
120 The Collaborative Study Group of the Transgenic Mouse Mutation Assay MMSGotEMSoJ. Organ variation
    in the mutagenicity of ethylnitrosourea in MutaMouse: result of the Collaborative Study on the Transgenic
    Mutation Assay by JEMS/MMS. Environ Mol Mutagen 1996; 28: 363-375
121 Brooks TM, Dean SW. The detection of gene mutation in the tubular sperm of Muta Mice following a single
    intraperitoneal treatment with methyl methanesulphonate or ethylnitrosourea. Mutat Res 1997; 388(2-3):
    219-222
122 Cosentino L, Heddle JA. A test for neutrality of mutations of the lacZ transgene. Environ Mol Mutagen
    1996; 28(4): 313-316
123 Cruz-Munoz W, Kalair W, Cosentino L, Heddle JA. ENU induces mutations in the heart of lacZ transgenic
    mice. Mutat Res 2000; 469(1): 23-34
124 da Costa GG, Manjanatha MG, Marques MM, Beland FA. Induction of lacI mutations in Big Blue rats
    treated with tamoxifen and alpha-hydroxytamoxifen. Cancer Lett 2002; 176(1): 37-45
125 van Delft JH, Baan RA. Germ cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
    ethylnitrosourea; comparison with specific-locus test. Mutagenesis 1995; 10(3): 209-214
126 Dolle ME, Martus HJ, Gossen JA, Boerrigter ME, Vijg J. Evaluation of a plasmid-based transgenic mouse
    model for detecting in vivo mutations. Mutagenesis 1996; 11(1): 111-118
127 Douglas GR, Jiao J, Gingerich JD, Gossen JA, Soper LM. Temporal and molecular characteristics of
    mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa
    of lacZ transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(16): 7485-7489
128 Douglas GR, Jiao J, Gingerich JD, Soper LM, Gossen JA. Temporal and molecular characteristics of lacZ
    mutations in somatic tissues of transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 317-324
129 Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM, Jiao J. Toward an understanding of the use of transgenic mice for
    the detection of gene mutations in germ cells. Mutat Res 1997; 388(2-3): 197-212
130 Gorelick NJ, Andrews JL, Gibson DP, Carr GJ, Aardema MJ. Evaluation of lacI mutation in germ cells and
    micronuclei in peripheral blood after treatment of male lacI transgenic mice with ethylnitrosourea,
    isopropylmethane sulfonate or methylmethane sulfonate. Mutat Res 1997; 388(2-3): 187-195
131 Itoh S, Miura M, Shimada H. Lack of mutagenicity of levofloxacin in lacZ transgenic mice. Mutagenesis
    1998; 13(1): 51-55
132 Liegibel UM, Schmezer P. Detection of the two germ cell mutagens ENU and iPMS using the LacZ/
    transgenic mouse mutation assay. Mutat Res 1997; 388(2-3): 213-218
133 Morrison V, Tinwell H, Ashby J. Consideration of the liver of embryonic lacZ transgenic mice as an
    analogue of the mouse coat colour spot test: preliminary data and technical problems. Mutat Res 1995;
    329(2): 107-112
    Literatuur                                                                                                47
</pre>

====================================================================== Einde pagina 47 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 48 ======================================================================

<pre>134 Provost GS, Short JM. Characterization of mutations induced by ethylnitrosourea in seminiferous tubule
    germ cells of transgenic B6C3F1 mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91(14): 6564-6568
135 Provost GS, Rogers BJ, Dycaico MJ, Carr G. Evaluation of the transgenic Lambda/LacI mouse model as a
    short-term predictor of heritable risk. Mutat Res 1997; 388(2-3): 129-136
136 Skopek TR, Kort KL, Marino DR. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in
    ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen 1995; 26(1): 9-15
137 Suzuki T, Itoh S, Takemoto N, Yajima N, Miura M, Hayashi M et al. Ethyl nitrosourea and methyl
    methanesulfonate mutagenicity in sperm and testicular germ cells of lacZ transgenic mice (Muta Mouse).
    Mutat Res 1997; 388(2-3): 155-163
138 Tinwell H, Lefevre P, Williams CV, Ashby J. The activity of ENU, iPMS and MMS in male mouse germ
    cells using the Muta Mouse positive selection transgenic mutation assay. Mutat Res 1997; 388(2-3): 179-
    185
139 Walker VE, Gorelick NJ, Andrews JL, Craft TR, deBoer JG, Glickman BW et al. Frequency and spectrum
    of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI
    transgenic mice. Cancer Res 1996; 56(20): 4654-4661
140 Winegar RA, Carr G, Mirsalis JC. Analysis of the mutagenic potential of ENU and MMS in germ cells of
    male C57BL/6 lacI transgenic mice. Mutat Res 1997; 388(2-3): 175-178
141 Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM. Evidence for in vivo non-mutagenicity of the carcinogen hydrazine
    sulfate in target tissues of lacZ transgenic mice. Carcinogenesis 1995; 16(4): 801-804
142 Chen T, Mittelstaedt RA, Aidoo A, Hamilton LP, Beland FA, Casciano DA et al. Comparison of hprt and
    lacI mutant frequency with DNA adduct formation in N-hydroxy-2-acetylaminofluorene-treated Big Blue
    rats. Environ Mol Mutagen 2001; 37(3): 195-202
143 Frijhoff AF, Krul CA, de Vries A, Kelders MC, Weeda G, van Steeg H et al. Influence of nucleotide
    excision repair on N-hydroxy-2-acetylaminofluorene-induced mutagenesis studied in lambda lacZ-
    transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1998; 31(1): 41-47
144 Pletsa V, Steenwinkel MJ, van Delft JH, Baan RA, Kyrtopoulos SA. Methyl bromide causes DNA
    methylation in rats and mice but fails to induce somatic mutations in lambda lacZ transgenic mice. Cancer
    Lett 1999; 135(1): 21-27
145 Rihn BH, Bottin MC, Coulais C, Rouget R, Monhoven N, Baranowski W et al. Genotoxicity of 3-
    methylcholanthrene in liver of transgenic big Blue mice. Environ Mol Mutagen 2000; 36(4): 266-273
146 Itoh S, Miura M, Shimada H. Germ cell mutagenesis in lacZ transgenic mice treated with methyl
    methanesulfonate. Mutat Res 1997; 388(2-3): 223-228
147 Brault D, Bouilly C, Renault D, Thybaud V. Tissue-specific induction of mutations by acute oral
    administration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and beta-propiolactone to the Muta Mouse:
    preliminary data on stomach, liver and bone marrow. Mutat Res 1996; 360(2): 83-87
148 Brault D, Renault D, Tombolan F, Thybaud V. Kinetics of induction of DNA damage and lacZ gene
    mutations in stomach mucosa of mice treated with beta-propiolactone and N-methyl-N'-nitro-N-
    nitrosoguanidine, using single-cell gel electrophoresis and MutaMouse models. Environ Mol Mutagen
    1999; 34(2-3): 182-189
48  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 48 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 49 ======================================================================

<pre>149 Monroe JJ, Kort KL, Miller JE, Marino DR, Skopek TR. A comparative study of in vivo mutation assays:
    analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big
    Blue mice. Mutat Res 1998; 421(1): 121-136
150 Provost GS, Kretz PL, Hamner RT, Matthews CD, Rogers BJ, Lundberg KS et al. Transgenic systems for in
    vivo mutation analysis. Mutat Res 1993; 288(1): 133-149
151 Quillardet P, Michel V, Arrault X, Hofnung M, Touati E. Mutagenic properties of a nitrofuran, 7-methoxy-
    2-nitronaphtho[2, 1-b]furan (R7000), in lacI transgenic mice. Mutat Res 2000; 470(2): 177-188
152 Suzuki T, Hayashi M, Sofuni T, Myhr BC. The concomitant detection of gene mutation and micronucleus
    induction by mitomycin C in vivo using lacZ transgenic mice. Mutat Res 1993; 285(2): 219-224
153 Guttenplan JB, Kosinska W, von Pressentin MM, Rosa J, El Bayoumy K. Effects of 1,4-
    phenylenebis(methylene)selenocyanate (p-XSC) and vitamin E on 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO)-
    induced mutagenesis in lacZ mouse upper aerodigestive tissue. Mutat Res 2002; 518(1): 85-93
154 von Pressentin MM, El Bayoumy K, Guttenplan JB. Mutagenic activity of 4-nitroquinoline-N-oxide in
    upper aerodigestive tissue in lacZ mice (MutaMouse) and the effects of 1, 4-
    phenylenebis(methylene)selenocyanate. Mutat Res 2000; 466(1): 71-78
155 Nakajima M, Kikuchi M, Saeki K, Miyata Y, Terada M, Kishida F et al. Mutagenicity of 4-nitroquinoline 1-
    oxide in the MutaMouse. Mutat Res 1999; 444(2): 321-336
156 Jiao J, Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM. Analysis of tissue-specific lacZ mutations induced by N-
    nitrosodibenzylamine in transgenic mice. Carcinogenesis 1997; 18(11): 2239-2245
157 Itoh S, Miura M, Itoh T, Miyauchi Y, Suga M, Takahashi Y et al. N-Nitrosodi-n-propylamine induces organ
    specific mutagenesis with specific expression times in lacZ transgenic mice. Mutat Res 1999; 444(2): 309-
    319
158 Hara T, Hirano K, Hirano N, Tamura H, Sui H, Shibuya T et al. Mutation induction by N-propyl-N-
    nitrosourea in eight MutaMouse organs. Mutat Res 1999; 444(2): 297-307
159 Schmezer P, Eckert C, Liegibel UM. Tissue-specific induction of mutations by streptozotocin in vivo.
    Mutat Res 1994; 307(2): 495-499
160 Chen T, Aidoo A, Manjanatha MG, Mittelstaedt RA, Shelton SD, Lyn-Cook LE et al. Comparison of
    mutant frequencies and types of mutations induced by thiotepa in the endogenous Hprt gene and transgenic
    lacI gene of Big Blue rats. Mutat Res 1998; 403(1-2): 199-214
161 de Boer JG, Holcroft J, Cunningham ML, Glickman BW. Tris(2,3-dibromopropyl)phosphate causes a
    gradient of mutations in the cortex and outer and inner medullas of the kidney of lacI transgenic rats.
    Environ Mol Mutagen 2000; 36(1): 1-4
162 Shane BS, Smith-Dunn DL, deBoer JG, Glickman BW, Cunningham ML. Subchronic administration of
    phenobarbital alters the mutation spectrum of lacI in the livers of Big Blue transgenic mice. Mutat Res
    2000; 448(1): 69-80
163 Lefevre PA, Tinwell H, Galloway SM, Hill R, Mackay JM, Elcombe CR et al. Evaluation of the genetic
    toxicity of the peroxisome proliferator and carcinogen methyl clofenapate, including assays using Muta
    Mouse and Big Blue transgenic mice. Hum Exp Toxicol 1994; 13(11): 764-775
    Literatuur                                                                                                    49
</pre>

====================================================================== Einde pagina 49 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 50 ======================================================================

<pre>164 DeMarini DM, Shelton ML, Kohan MJ, Hudgens EE, Kleindienst TE, Ball LM et al. Mutagenicity in lung
    of big Blue((R)) mice and induction of tandem-base substitutions in Salmonella by the air pollutant
    peroxyacetyl nitrate (PAN): predicted formation of intrastrand cross-links. Mutat Res 2000; 457(1-2): 41-55
165 Gezondheidsraad. Chloroform en tetrachloormethaan; Toetsing van een criteriadocument. Rijswijk:
    Gezondheidsraad; 1987: publicatie nr 1987/15.
166 Gezondheidsraad: Commissie Risico-evaluatie van stoffen - dioxinen. Dioxinen. Polygechloreerde dibenzo-
    p-dioxinen, dibenzofuranen en dioxine-achtige polychloorbifenylen. Rijswijk: Gezondheidsraad; 1996:
    publicatie nr 1996/10.
167 Thornton AS, Oda Y, Stuart GR, Glickman BW, de Boer JG. Mutagenicity of TCDD in Big Blue transgenic
    rats. Mutat Res 2001; 478(1-2): 45-50
168 Provost GS. Evaluation of mutagenic and non-mutagenic compounds using LacI transgenic rodents.
    Environ-Mol-Mutagen 23 (Suppl 23), 55. 1994.
169 Kohara A, Suzuki T, Honma M, Ohwada T, Hayashi M. Mutagenicity of aristolochic acid in the lambda/
    lacZ transgenic mouse (MutaMouse). Mutat Res 2002; 515(1-2): 63-72
170 Gezondheidsraad. Asbest; toetsing van een ontwerp-basisdocument. Den Haag: Gezondheidsraad; 1988:
    publicatie nr 1988/31.
171 Rihn B, Coulais C, Kauffer E, Bottin MC, Martin P, Yvon F et al. Inhaled crocidolite mutagenicity in lung
    DNA. Environ Health Perspect 2000; 108(4): 341-346
172 Topinka J, Loli P, Georgiadis P, Dusinska M, Hurbankova M, Kovacikova Z et al. Mutagenesis by asbestos
    in the lung of lambda-lacI transgenic rats. Mutat Res 2004; 553(1-2): 67-78
173 Unfried K, Schurkes C, Abel J. Distinct spectrum of mutations induced by crocidolite asbestos: clue for 8-
    hydroxydeoxyguanosine-dependent mutagenesis in vivo. Cancer Res 2002; 62(1): 99-104
174 Ashby J. Results for the big blue transgenic assay using two genotoxins and a peroxisome proliferator.
    Environ Mol Mutagen 1993; 21 (suppl 22): 4
175 Leavitt SA, DeAngelo AB, George MH, Ross JA. Assessment of the mutagenicity of dichloroacetic acid in
    lacI transgenic B6C3F1 mouse liver. Carcinogenesis 1997; 18(11): 2101-2106
176 Rompelberg CJ, Steenwinkel MJ, van Asten JG, van Delft JH, Baan RA, Verhagen H. Effect of eugenol on
    the mutagenicity of benzo[a]pyrene and the formation of benzo[a]pyrene-DNA adducts in the lambda-lacZ-
    transgenic mouse. Mutat Res 1996; 369(1-2): 87-96
177 Miyata Y, Saeki K, Kawazoe Y, Hayashi M, Sofuni T, Suzuki T. Antimutagenic structural modification of
    quinoline assessed by an in vivo mutagenesis assay using lacZ-transgenic mice. Mutat Res 1998; 414(1-3):
    165-169
178 Culp SJ, Beland FA, Heflich RH, Benson RW, Blankenship LR, Webb PJ et al. Mutagenicity and
    carcinogenicity in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite green. Mutat Res 2002; 506-
    507: 55-63
179 Arrault X, Michel V, Quillardet P, Hofnung M, Touati E. Comparison of kinetics of induction of DNA
    adducts and gene mutations by a nitrofuran compound, 7-methoxy-2-nitronaphtho[2,1-b]furan (R7000), in
    the caecum and small intestine of Big Blue mice. Mutagenesis 2002; 17(4): 353-359
50  Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 50 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 51 ======================================================================

<pre>180 Nishikawa A, Furukawa F, Kasahara K, Ikezaki S, Itoh T, Suzuki T et al. Trans-4-hydroxy-2-nonenal, an
    aldehydic lipid peroxidation product, lacks genotoxicity in lacI transgenic mice. Cancer Lett 2000; 148(1):
    81-86
181 Takahashi S, Ikeda Y, Kimoto N, Okochi E, Cui L, Nagao M et al. Mutation induction by mechanical
    irritation caused by uracil-induced urolithiasis in Big Blue rats. Mutat Res 2000; 447(2): 275-280
    Literatuur                                                                                                  51
</pre>

====================================================================== Einde pagina 51 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 52 ======================================================================

<pre>52 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 52 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 53 ======================================================================

<pre>A Adviesaanvraag
B Commissie
C Begrippenlijst
D Overzicht van stoffen en hun testuitslagen
  Bijlagen
                                             53
</pre>

====================================================================== Einde pagina 53 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 54 ======================================================================

<pre>54 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 54 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 55 ======================================================================

<pre>Bijlage A
        Adviesaanvraag
        Op 3 april 2002 stuurde de minister van Volksgezondheid, Welzijn en Sport een brief
        (kenmerk: GZB/C&O/2268208) aan de voorzitter van de Gezondheidsraad met de vol-
        gende inhoud:
        Door TNO en RIVM is een rapport opgesteld getiteld ‘Mutagenicity of chemicals in genetically modified
        animals’ in opdracht van het ministerie van SZW en het ministerie van VWS. In het rapport wordt ingegaan
        op nieuwe testmodellen voor het onderzoek naar mutagene eigenschappen van stoffen.
              Het onderzoek naar de mutageniteit is van groot belang bij de toelating van nieuwe stoffen en bij de
        beoordeling van prioritair gestelde bestaande stoffen. Mutageniteit speelt bij de beoordeling van stoffen een
        sleutelrol met name in verband met de eventuele kankerverwekkendheid en de mogelijkheid van het veroor-
        zaken van erfelijke afwijkingen. Bij indeling van de stof als bewezen mutageen en/of kankerverwekkend
        wordt de toepassing van de stof voor de consument verboden.
              Tot nu toe zijn er geen goede gevalideerde in vivo genmutatie testen voorhanden, waardoor de mutage-
        niteit van de stof afdoende bepaald kan worden. In het rapport wordt een overzicht gegeven van veelbelo-
        vende in vivo genmutatie testen, uitgevoerd met ‘transgene’ muizen.
              Graag zou ik van u advies ontvangen of (en welke) nieuwe in vivo genmutatie testen in de routine van
        de beoordeling van stoffen ingezet kunnen worden en wat de eventuele beletselen daarbij kunnen zijn.
        Hoogachtend,
        de Minister van Volksgezondheid, Welzijn en Sport,
        w.g. dr E Borst-Eilers
        Adviesaanvraag                                                                                                55
</pre>

====================================================================== Einde pagina 55 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 56 ======================================================================

<pre>56 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 56 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 57 ======================================================================

<pre>Bijlage B
        Commissie
        De commissie die het advies heeft opgesteld bestond uit:
        • dr GMH Swaen, voorzitter tot 1 september 2004
           epidemioloog; Universitair Medisch Centrum, Maastricht (tot 1 september 2004),
           Dow Benelux BV, Terneuzen (vanaf 1 september 2004)
        • dr PJ Boogaard
           toxicoloog; Shell International BV, Den Haag
        • drs HC Dreef - van der Meulen
           toxicologisch patholoog; NV Organon, Oss
        • prof dr VJ Feron (tot 19 februari 2004)
           emeritus hoogleraar biologische toxicologie; Zeist
        • prof dr H van Loveren (vanaf 14 november 2003)
           hoogleraar immunotoxicologie, Universiteit Maastricht; tevens Rijksinstituut voor
           Volksgezondheid en Milieu, Bilthoven
        • prof dr GR Mohn (tot 1 januari 2004)
           hoogleraar cellulaire mutatie-genetica, Leids Universitair Medisch Centrum
        • prof dr GJ Mulder
           hoogleraar toxicologie, Leiden/Amsterdam Center for Drug Research, Leiden
        • dr MJM Nivard
           moleculair bioloog en genetisch toxicoloog, Leids Universitair Medisch Centrum
        • dr PC Noordam, adviseur (tot 19 februari 2004)
           Ministerie van Sociale Zaken en Werkgelegenheid, Den Haag
        Commissie                                                                            57
</pre>

====================================================================== Einde pagina 57 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 58 ======================================================================

<pre>   •  dr H te Riele
      moleculair bioloog; Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam
   •  dr H Roelfzema, adviseur
      Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport, Den Haag
   •  prof dr W Slob
      hoogleraar kwantitatieve risicobeoordeling, Universiteit Utrecht; tevens Rijksinsti-
      tuut voor Volksgezondheid en Milieu, Bilthoven
   •  prof dr ALM Verbeek
      hoogleraar klinische epidemiologie, Radboud Universiteit Nijmegen
   •  prof. dr ir AA van Zeeland (vanaf 1 februari 2004, voorzitter vanaf 1 september
      2004)
      hoogleraar moleculaire stralingsdosimetrie en stralingsmutagenese, Leids Universi-
      tair Medisch Centrum
   •  prof dr EJJ van Zoelen
      hoogleraar celbiologie, Radboud Universiteit Nijmegen
   •  dr JA van Zorge, adviseur
      Ministerie van Volkshuisvesting, Ruimtelijke Ordening en Milieubeheer, Den Haag
   •  dr ir PW van Vliet, secretaris
      Gezondheidsraad, Den Haag
   Aan het advies hebben de volgende deskundigen een bijdrage geleverd:
   • dr J van Benthem
      genetisch toxicoloog; Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu, Bilthoven
   • dr GR Douglas
      genetisch toxicoloog; Health Canada, Ottawa, Canada
   • dr CAM Krul
      genetisch toxicoloog; TNO Voeding, Zeist
   • prof dr IB Lambert
      hoogleraar biologie en biochemie, Carleton University, Ottawa, Canada
   • dr MD Shelby
      genetisch toxicoloog; National Institute of Environmental Health Sciences,
      Research Triangle Park, VS
   • dr V Thybaud
      genetisch toxicoloog; Aventis Pharma, Vitry-sur-Seine, Frankrijk
58 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 58 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 59 ======================================================================

<pre>Bijlage C
        Begrippenlijst
        carcinogeen                     kankerverwekkend
        DNA                             erfelijk materiaal
        endogeen                        van nature aanwezig
        gen                             drager van een erfelijke eigenschap
        genetisch gemodificeerde dieren dieren waarvan de celkern in alle lichaamscellen DNA bevat met
                                        dezelfde verandering
        genmutatie                      verandering binnen een gen, zoals een basepaarsubstitutie (vervanging
                                        van een basepaar in het DNA door een ander basepaar) en een kleine
                                        deletie (verlies van een stukje van het DNA)
        genotoxiciteit                  vermogen om potentieel schadelijke veranderingen in het DNA aan te
                                        brengen
        gevoeligheid                    kans dat een genotoxische stof positief scoort
        mutageniteit                    vermogen om mutaties te veroorzaken
        mutatie                         permanente, overdraagbare wijziging in de hoeveelheid of structuur van
                                        het erfelijk materiaal van cellen of organismen
        mutatiefrequentie               het aantal mutaties per reportergenkopie
        negatieve voorspellende waarde  kans dat een negatieve score betekent dat de stof niet genotoxisch is
        positieve voorspellende waarde  kans dat een stof die positief scoort genotoxisch is
        reportergen                     gen dat op genmutaties wordt onderzocht
        specificiteit                   kans dat een niet-genotoxische stof negatief scoort
        transgeen                       ingevoegd door middel van genetische modificatie
        Begrippenlijst                                                                                         59
</pre>

====================================================================== Einde pagina 59 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 60 ======================================================================

<pre>60 Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren</pre>

====================================================================== Einde pagina 60 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 61 ======================================================================

<pre>Bijlage      D
             Overzicht van stoffen en hun
             testuitslagen
stof                    carcinogeniteita genotoxiciteitb           BBc  MM organen/                referenties
                                                                           weefselsd               BB/MM
                                         in vitro   in vivo totaal
genotoxisch
2-acetylaminofluoreen   +                +          +       +      e                               32
                                                                        +  lever 1,6
                                                                                                   33
                                                                        +  lever 5
                                                                                                   34
                                                                   +(m)    lever 3
                                                                                                   35
                                                                        +  lever 3
acrylamide              + (2A)           +          +       +36         +  beenmerg 6              37
                                                                                                   38
                                                                        -  lever 2
                                                                                                   39
                                                                        +  beenmerg 3
                                                                                                   40
adozelesine                              +          +       +      +(m)    lever 3
aflatoxine              + (1)            +          +       +41    -(m)    lever 4, nier 3         42
                                                                                                   43, 44
                                                                   +(r)    lever 3
                                                                                                   45
                                                                   -(m)    lever 1,3
                                                                   +(r)    lever 20                45
o-aminoazotolueen       + (2B)           +          +       +           +  lever 3, colon 6, been-46
                                                                           merg 1, long 1,2, nier
                                                                           3, blaas 2, testis 3
                                                                                                   47
4-aminobifenyl          +(1)             +          +       +           +  blaas 14, lever 5,
                                                                           beenmerg 2
                                                                   +(r)    lever 3, nier 7, blaas 448
             Overzicht van stoffen en hun testuitslagen                                                    61
</pre>

====================================================================== Einde pagina 61 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 62 ======================================================================

<pre>2-amino-3,4-dime-         + (2B)        +        +         +   +(m)   colon 38, beenmerg 6, 49,50
thylimidazo[4,5-ƒ]quino-                                              lever 5, voormaag 3
line (MeIQ)
                          + (2B)        +        +         +        + lever 4                 51
2-amino-3,8-dime-
thylimidazo[4,5-ƒ]qui-                                                                        52
                                                               +(m)   lever 9, colon 4
noxaline (MeIQx)                                                    + lever 55                53
2-amino-3-me-             + (2A)        +        +         +   +(r)   lever 4, colon 3, nier 54
thylimidazo[4,5-ƒ]quino-                                              2
line (IQ)                                                           + lever 4                 51
2-amino-1-methyl-6-phe- +(2B)           +        +         +        + dikke darm 6, dunne 55
nylimidazo[4,5-b]pyridine                                             darm 4, lever 1,6, nier
(PhIP)                                                                1
                                                               +(r)   colon 25                56
                                                               +(r)   prostaat 20             57
                                                               +(r)   blinde darm 7, colon 58
                                                                      21
                                                               +(r)   colon 16                59
                                                                                              60
                                                               +(r)   prostaat 5
                                                               +(m)   colon 3                 61
                                                                                              51
2-amino-9H-pyrido[2,3-    + (2B)        +        +         +        + lever 3
b]indool (AαC)
arseentrioxide            +(1)          +        +         +62      - long 1,0, nier 1,0,     63
                                                                      beenmerg ?, blaas ?
benzeen                   + (1)         +        +         +64 +(m)   beenmerg 1,5, milt      65
                                                                      1,5, long 1,3
benzo[a]pyreen            + (2A)        +        +         +66      + huid 11, lever 0,9,     67
                                                                      long 1,1
                                                                    + colon 37, ileum 24, 68
                                                                      voormaag 15, been-
                                                                      merg 18, milt 25,
                                                                      maag 9, lever 5, long
                                                                      4, nier 4, hart 2, her-
                                                                      senen 1,5
                                                                                              69,70
                                                               +(m)   milt 13
                                                               +(r)   long 2                  71
                                                               +(m)   milt-T-cellen 9         72
1,3-butadieën             + (2A)        +        +         +        + long 2, beenmerg 0,7, 73,74
                                                                      lever 1,3
                                                                                              74
                                                               +(m)   beenmerg 4
                                                                                              75
                                                               +(m)   beenmerg 6
                                                                                              76
                                                               +(m)   beenmerg 4
                                                                                              40
CC-1065                                 +        +         +   +(m)   lever 3
62            Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 62 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 63 ======================================================================

<pre>chlorambucil               + (1)        +         +      +          + beenmerg 3, lever 10, 37
                                                                      testis 22
                                                                                               39
                                                                    + beenmerg 2
                                                            41                                 77-79
4-chloor-o-fenyleendia-    + (2B)       +         +      +     +(m)   lever 8
mine
chroom(VI)-verbindingen + (1)           +         +      + 80       + beenmerg 1, lever 2 81
                                                                    + beenmerg 2, lever 2 82
                                                               +(m)   long 5, nier 4, lever 4 83
                                                           84                                  85
cisplatina                 + (2A)       +         +      +          + lever 2
cyclofosfamide             + (1)        +         +      +41   +(m)   long 3, blaas 3, nier 86
                                                                      1,4, beenmerg 1,5
                                                                    + beenmerg 6               37
                                                                                               87
                                                               +(m)   testis 0,9, milt 0,8,
                                                                      lever 1,9
                                                                                               69,70
                                                               +(m)   milt 3
                                                                    + beenmerg 3               39
                                                               -(m)   milt-T-lymfocyten 1,288
                                                                                               89
cyproteronacetaat          + (2B)       +         +      +     +(r)   lever 4
2,4-diaminotolueen         + (2B)       +                +     +(m)   lever 2                  90,91
                                                                                               78
                                                               +(m)   lever 2
di-ethylnitrosamine (DEN) + (2A)        +         +      +          + beenmerg 1, lever 7 92
(N-ethyl-N-nitroso-ethaan-                                          + lever 19                 93
amine)                                                              + beenmerg ongeveer 1, 94
                                                                      lever ongeveer 3
                                                                    + lever 6, nier 2, long 2, 95
                                                                      blaas 1,1, beenmerg
                                                                      1,3, testis 0,8
dimethylnitrosamine        + (2A)       +         +      +96   +(m)   lever 4, blaas 1         97
(DMN) (N-methyl-N-
nitroso-methaanamine)
                                                               +(m)   lever 3                  90,91
                                                               +(m)   lever 37                 98
                                                                                               99
                                                               +(m)   lever 16
                                                                    + neusmucosa 10, long 100
                                                                      1,2, lever 2
                                                                                               101
                                                               +(m)   lever 2
                                                                                               101
                                                                    + lever 5
                                                                                               102
                                                               +(m)   lever 2
                                                                                               103
                                                               +(m)   lever 6
                                                               +(m)   voormaag 1,1, lever 104,105
                                                                      2, long 1,2
              Overzicht van stoffen en hun testuitslagen                                             63
</pre>

====================================================================== Einde pagina 63 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 64 ======================================================================

<pre>                                                               +(m)   lever 6, nier 2, long 2, 95
                                                                      beenmerg 1,3, blaas
                                                                      1,3, testis 0,8
                                                                                                106
                                                                    + lever 5, milt 3
                                                                                                22
                                                               +(m)   lever 4
                                                                                                22
                                                                    + lever 6
                                                                                                35
                                                                    + lever 5
                                                                                                107
6-(p-dimethylamino-     +              +        +         +    +(r)   lever 10
fenylazo)benzothiazol
                        +              +        +         +         + huid 3                    108
7,12-dimethyl-
benzo[a]anthraceen                                                                              109
                                                                    + huid 15
(DMBA)                                                              + beenmerg 30, lever 110
                                                                      12, colon 3, zwezerik
                                                                      4, huid 3, nier 1,1,
                                                                      testis 3
                                                                                                37
                                                                    + beenmerg 3, huid 6
                                                                                                111
                                                               +(m)   huid 6
                                                                                                39
                                                                    + huid 4
                                                                                                46
                                                                    + lever 2, colon 1,5,
                                                                      beenmerg 9, long 0,5,
                                                                      nier 1, blaas 1,6, testis
                                                                      5
                                                                                                112
5,9-dimethyldi-         +                       +         +         + lever 58
benzo(c,g)carbazol                                                  + lever 3                   113
ethyleenoxide           + (2A)         +        +         +114 +(m)   long 1,4, milt 2, zaad- 115
                                                                      cellen -
                                                               +(m)   long 1,5, beenmerg 116
                                                                      1,9, milt 1,9, zaadka-
                                                                      nalen uit testis 1,0,
                                                                      milt-B- en T-cellen 4
ethylmethaansulfonaat   + (2B)         +        +         +84       + zaadcellen uit epidi- 117
                                                                      dymis en vas deferens
                                                                      2
                                                                    + dunne darm 2, milt 3 118
                                                                    - lever 1, beenmerg 2, 92
                                                                      hersenen 1,5
                                                                    + beenmerg 5, lever 1,8 119
                                                                                                120
N-ethyl-N-nitroso-ureum + (2A)         +        +         +         + lever 2,0, milt 18,
(ENU)                                                                 beenmerg 19, herse-
                                                                      nen 1,6, long 2, nier
                                                                      2, blaas 11, hart 2
64           Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 64 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 65 ======================================================================

<pre>                                                + zaadcellen uit testis 5 121
                                                                          122
                                                + dunne darm 28
                                                                          123
                                                + hart 5, dunne darm
                                                  1,3
                                           +(r)   lever 11, baarmoeder 124
                                                  14
                                                + zaadcellen uit epidi- 125
                                                  dymis en vas deferens
                                                  9
                                                + zaadcellen uit epidi- 117
                                                  dymis en vas deferens
                                                  6
                                                + dunne darm 11, milt 6 118
                                                                          126
                                                + milt 14
                                                + zaadcellen uit testis 127
                                                  18, uit vas deferens 4
                                                + beenmerg 34, lever 11128
                                                + zaadcellen uit testis 129
                                                  16, uit epididymis 9
                                           +(m)   zaadkanalen uit testis 130
                                                  1,5, zaadcellen uit
                                                  epididymis 2
                                                + beenmerg 40, lever      37
                                                  27, testis 32
                                                + beenmerg 31, lever 6 81
                                                + beenmerg 50, lever 3, 131
                                                  testis 2, epididymis 2
                                                + testis 10               26
                                           +(m)   zaadkanalen uit testis 69,70
                                                  4, milt 8
                                                + lever 7                 38
                                                + testis 7                132
                                                + lever 4, beenmerg 23, 92
                                                  hersenen -
                                           +(m)   lever 3                 40
                                                + (lever 1, embryonale 133
                                                  lever 4)
                                                + beenmerg 40, lever      39
                                                  17
                                           +(m)   zaadcellen uit testis   134
                                                  20
                                           +(m)   zaadkanalen uit testis 135
                                                  3, zaadcellen uit epi-
                                                  didymis 0,7
Overzicht van stoffen en hun testuitslagen                                     65
</pre>

====================================================================== Einde pagina 65 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 66 ======================================================================

<pre>                                                                       + long 4, beenmerg 24, 73,74
                                                                         lever 5
                                                                                                 74
                                                                  +(m)   beenmerg 20
                                                                                                 75
                                                                  +(m)   beenmerg 35
                                                                                                 136
                                                                  +(m)   milt-T-cellen 8
                                                                                                 94
                                                                       + beenmerg, lever
                                                                       + beenmerg 10, lever 2 119
                                                                       + zaadkanalen testis 5, 137
                                                                         zaadcellen uit epidi-
                                                                         dymis en vas deferens
                                                                         1,3
                                                                                                 138
                                                                       + testis 16
                                                                  +(m)   milt-T-cellen 3         139
                                                                  +(m)   zaadkanalen uit testis 140
                                                                         5
                                                                                                 35
etoposide                 +(2A)          +       +        +            + beenmerg 1,3
hydrazinesulfaat          +              +       +        +            - (long 1,3, lever 1,3, 141
                          (hydrazine 2B) (hydra- (hydra-  (hydra-        beenmerg 0,9)
                                         zine)   zine)    zine)
N-hydroxy-2-acetylami-    +              +       +        +       +(r)   lever 40, milt 3        142
nofluoreen                                                             - lever 2                 143
isopropylmethaansulfonaat +                      +        +            + testis 7, epididymis 4 129
                                                                  +(m)   zaadkanalen uit testis 130
                                                                         1,3
                                                                       + testis 5, epididymis 3, 26
                                                                         vas deferens 4
                                                                       + testis 2                132
                                                                  +(m)   zaadkanalen uit testis 135
                                                                         3, zaadcellen uit epi-
                                                                         didymis 0,8
                                                                       + testis 4                138
methylbromide             +/- (3)        +       +        +            - (lever 1,3, kliermaag 144
                                                                         0,7)
3-methylcholantreen       +              +       +        +       +(m)   lever 1,3, voormaag 145
                                                                         0,8
methylmethaansulfonaat    + (2B)         +       +        +84          - zaadcellen uit testis   121
                                                                         1,3
                                                                       + zaadcellen uit epidi- 117
                                                                         dymis en vas deferens
                                                                         1,5
                                                                       - zaadkanalen uit testis 129
                                                                         1,3, zaadcellen uit
                                                                         epididymis 1,1
66           Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 66 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 67 ======================================================================

<pre>                                                             -(m)   zaadkanalen uit testis 130
                                                                    1,1
                                                                  - testis 1,3, zaadcellen 146
                                                                    uit epididymis en vas
                                                                    deferens 1,0, milt 1,1
                                                                                           132
                                                                  - testis 1
                                                                                           99
                                                             +(m)   lever 1,7
                                                             -(m)   zaadkanalen uit testis 135
                                                                    1,3, zaadcellen uit
                                                                    epididymis 0,9
                                                                  - zaadkanalen uit testis 137
                                                                    1,2, zaadcellen uit
                                                                    epididymis en vas
                                                                    deferens 1,1
                                                                  - testis 1,2, zaadcellen 138
                                                                    uit epididymis 0,9
                                                                  - lever 2, beenmerg 1,5 35
                                                             -(m)   zaadkanalen uit testis 140
                                                                    1,4
N-methyl-N’-nitro-N-     + (2A)         +         +      +        + maag 6, lever -, been- 147
nitroso-guanidine (MNNG)                                            merg -
                                                                  + maag 19                148
                                                                  + maag 13, lever 1,3,    109
                                                                    huid 78
                                                                  + huid 5                 39
N-methyl-N-nitroso-ureum + (2A)         +         +      +        + zaadcellen uit epidi- 117
(MNU)                                                               dymis en vas deferens
                                                                    6
                                                                  + dunne darm 6, milt 2 118
                                                                                           70
                                                             +(m)   milt 75, lever 11
                                                                                           149
                                                             +(m)   milt-T-cellen 3
                                                             +(m)   hersenen 3, long 23, 150
                                                                    zaadcellen 6
                                                             +(m)   voormaag 1,3, lever 104,105
                                                                    2, long 1,2, nier 1
                                                                                           151
                                                             +(m)   milt 12
mitomycine C             + (2B)         +         +      +84      + (beenmerg 1,7, lever 152
                                                                    0,5)
4-nitroquinoline-1-oxide +              +         +      +        + tong 39, slokdarm 20, 153
                                                                    gepoold mondweef-
                                                                    sel 54
              Overzicht van stoffen en hun testuitslagen                                        67
</pre>

====================================================================== Einde pagina 67 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 68 ======================================================================

<pre>                                                                    + tong 34, slokdarm 24, 154
                                                                      gepoold mondweef-
                                                                      sel 15, long 0,8, lever
                                                                      0,7, colon 0,8
                                                                    + lever 9, beenmerg 51, 155
                                                                      testis 3, nier 1,2, milt
                                                                      1,2, long 1,6,
                                                                      maag 55
N-nitroso-dibenzylamine                 +        +         +        + beenmerg 1,7, lever 4 156
N-nitroso-dipropylamine  + (2B)         +        +         +        + beenmerg 2, lever 12, 157
                                                                      long 3, nier 1,4, blaas
                                                                      1,0, testis 0,5
N-propyl-N-nitroso-ureum +                       +         +        + beenmerg 8, lever 2, 158
                                                                      long 1,9, nier 2, milt
                                                                      3, testis 4, hersenen
                                                                      1,0, hart 2
procarbazine             + (2A)         +        +         +41      + beenmerg 91              37
                                                                                               39
                                                                    + beenmerg 30
                                                                                               147
β-propiolacton           + (2B)         +        +         +        + maag 9, lever 2,
                                                                      beenmerg -
                                                                                               148
                                                                    + maag 11
                                                                                               159
streptozotocine          + (2B)         +        +         +   +(m)   lever 2, nier 6
tamoxifen                + (1)          +        +         +   +(r)   lever 3, baarmoeder 124
                                                                      0,4
                                                                                               43, 44
                                                               +(r)   lever 3
thiotepa                 + (1)          +        +         +41 +(r)   miltlymfocyten 4         160
tris(2,3-dibroompropyl)- + (2A)         +        +         +41 +(m)   nier 1,5, maag 1,5,      65
fosfaat                                                               lever 1,2
                                                               +(r)   nierschors 6, nier-      161
                                                                      merg (binnenkant) 2,
                                                                      niermerg (buiten-
                                                                      kant) 4
urethaan                 + (2B)         +        +         +84 +(m)   voormaag 1,5, lever 104,105
                                                                      5, long 7
niet-genotoxisch
o-anisidine              + (2B)         +        -         -   +(m)   lever 1,5, blaas 2       97
di(2-ethylhexyl)ftalaat  +/- (3)        +/-      -         -   -(m)   lever 1,7                33
fenobarbital             + (2B)         +/-      -         -   -(m)   lever 1,2                33
                                                               -(m)   lever ongeveer 1         98
                                                                    + lever 1,4                162
                                                                    - lever 1,1                113
heptachlor               +/-(3)         +/-      -         -   -(m)   lever 2                  33
68            Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 68 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 69 ======================================================================

<pre>levofloxacine                           +         -      -         - beenmerg 1,0, lever 131
                                                                     1,2, testis 1,0, epidi-
                                                                     dymis 1,3
                                                                                             163
methylclofenapaat           +           -         -      -    -(m)   lever 1,2
                                                                                             163
                                                                   - lever 0,8
                                                                                             78
2-nitro-p-fenyleendiamine + (3)         +         -      -    +(m)   lever 2
                                                                                             103
oxazepam                    + (2B)      +         -      -    +(r)   lever 1,9
peroxyacetylnitraat                     +         -      -    +(m)   long 1,3                164
                                                                                             48
saccharine (natriumzout)    +/- (3)     +         -      -    -(r)   lever 1,2, (blaas 0)
tetrachloormethaan          + (2B)      +/-       -      -165 -(m)   lever ongeveer 1        98
                                                                   - lever 1,6               113
2,3,7,8-tetrachloordibenzo- + (1)       -         -      -166 -(r)   lever 1,0               167
p-dioxine
genotoxiciteit onvoldoende onderzocht
4-acetylaminofluoreen       -                                 -(?)   lever -, blaas -        168
aristolochinezuur           +           +                          + voormaag 33, nier 10, 169
                                                                     blaas 16, colon 9,
                                                                     maag 3, long 2, lever
                                                                     1, beenmerg 2, milt 3,
                                                                     testis 1,5
asbest                      + (1)       +                170  +(m)   long 2                  171
                                                              +(r)   long 1,6                71
                                                              +(r)   long 2                  172
                                                              +(r)   omentum 3               173
azijnzuur                               -                          + huid 8                  39
2,6-diaminotolueen          -           +                     -(m)   lever 1,0               90,91
1-(2-chloorethyl)-3-(4-     + (1)                             -(m)   beenmerg 9, lever -     174
methylcyclohexyl)-1-
nitroso-ureum (Methyl-
CCNU)
1-chloor-methylpyreen                   +                          + maag 1,3, huid 10       109
dichloorazijnzuur           +/- (3)     -         +/-         +(m)   lever 2                 175
dimethylarsinezuur                      +                          - long 1,3, nier 1,0,     63
                                                                     beenmerg ?, blaas ?
6,11-dimethyl-              +           +                          + huid 5                  108
benzo[b]nafto-[2,3-d]thio-
feen
                                                                                             176
eugenol                     +/- (3)     +/-                        - lever 0,9
3-fluoroquinoline           -           -                          - lever 1,0, beenmerg 177
                                                                     1,1, testis 1,6
                                                                                             177
5-fluoroquinoline           + rat       +                          + lever 5, beenmerg
                                                                     1,4, testis 1,6
                                                                                             42
foron                                                         -(m)   lever 2, nier 2
              Overzicht van stoffen en hun testuitslagen                                           69
</pre>

====================================================================== Einde pagina 69 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 70 ======================================================================

<pre>                                                                                                                                   178
leucomalachietgroen                                +/-                                +(r)                 lever 3
                                                                                                                                   48
D-limoneen                    +/- (3)              -                                  -(r)                 lever 1,1, nier 1,1
7-methoxy-2-nitro-            +                    +                                  +(m)                 milt 2, testis 1, maag 151
naftho[2,1-b]furaan                                                                                        1, slokdarm 1,3, lever
                                                                                                           0,8, dunne darm 3,
                                                                                                           blinde darm 4, colon
                                                                                                           2, blaas 2
                                                                                      +(m)                 dunne darm 5, blinde 179
                                                                                                           darm 5
                                                                                                                                   177
quinoline                     +                    +                                           +           (lever 4, beenmerg
                                                                                                           1,5, testis 1,4)
                                                                                               +           lever 4; nier, long en 106
                                                                                                           milt ongeveer 1
                                                                                                                                   43 44
toremifen                     +/- (3)              +/-         +/-                    -(r)                 lever 1,4
trans-4-hydroxy-2-nonenal                          +                                  -(m)                 long 1,1, lever 2, nier 180
                                                                                                           1,1
uracil                        +                                                       +(r)                 blaas 5                 181
a
     Tussen haakjes staat de IARC-classificatie vermeld:
     1: de stof is carcinogeen bij de mens
     2A: de stof is waarschijnlijk carcinogeen bij de mens (beperkt bewijs bij de mens, voldoende bewijs in proefdieren)
     2B: de stof is mogelijk carcinogeen bij de mens (beperkt bewijs bij de mens en onvoldoende bewijs in proefdieren, of inadequaat
     bewijs bij de mens, maar voldoende bewijs in proefdieren)
     3: de stof kan niet worden geclassificeerd voor wat betreft de carcinogeniteit bij de mens (de stof wordt in deze groep geplaatst als
     hij in geen van de andere groepen past)
     4: de stof is waarschijnlijk niet carcinogeen bij de mens (bewijs dat duidt op het ontbreken van carcinogene eigenschappen bij
     mensen en in proefdieren)
b
     Genotoxiciteit in vitro, in vivo en in totaal. Bij het totaaloordeel geven de in vivo bevindingen de doorslag. Het oordeel is geba-
     seerd op de uitslagen van klassieke genotoxiciteitstests en op indirect bewijs uit onder meer onderzoek naar de vorming van DNA-
     adducten
c
     (m): muis; (r): rat; (?): diersoort niet gerapporteerd; +: minstens een orgaan of weefsel positief; -: alle geteste organen en weefsels
     negatief
d
     onderzochte organen en weefsels met quotiënt van mutatiefrequenties van behandelde en controlegroep (tussen haakjes bij lage
     waarden en gepoolde analyse per groep of ontbrekende informatie over statistische bewerking); bij meerdere proefopzetten het
     hoogste getal; -: geen statistisch significante toename mutatiefrequentie, maar quotiënt onvermeld; ?: geen oordeel mogelijk
     (groepsgrootte onvoldoende)
e
     +: positief; +/-: twijfelachtig; - negatief; lege cel: niet of niet adequaat onderzocht.
70             Mutageniteitstests met reportergenen bij dieren
</pre>

====================================================================== Einde pagina 70 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 71 ======================================================================

<pre>The use of reporter genes for mutagenicity
testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 71 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 72 ======================================================================

<pre></pre>

====================================================================== Einde pagina 72 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 73 ======================================================================

<pre>Health Council of the Netherlands                         President
Health Council of the Netherlands
To the Minister of Health, Welfare and Sport
Subject            : Submission of advisory report on the use of reporter genes for mutagenicity
                     testing in animals
Your reference     : GZB/C&O/2268208
Our reference      : U-1715/EvV/RA/246-D10
Appendices         :2
Date               : 24 January 2005
Minister,
I hereby submit an advisory report on the use of reporter genes for mutagenicity testing in animals.
This was drawn up by the Committee on the Evaluation of the Carcinogenicity of Chemical
Substances, at the request of your ministerial predecessor. It was evaluated by the Standing
Committee on Health and Environment, together with various Dutch and foreign experts from
outside the Health Council of the Netherlands.
The Committee concludes that reporter-gene based assay systems in animals are not yet suitable
for the standardised testing of chemical substances for genotoxic properties. However, it notes that
opportunities already exist to reduce the procedural variation between tests based on such systems.
The Committee has set out the main points of these options. It feels that the details could best be
worked out within the framework of the OECD.
      Preparations are already being made for the OECD to develop the relevant guidelines. A
report on the use of reporter genes for mutagenicity testing in animals is also being drawn up
within the framework of the WHO’s International Programme on Chemical Safety. I would ask
you to consider making this report available to these organizations, for their inspection.
Today I have also submitted this advisory report to the State Secretary for Housing, Spatial
Planning and the Environment.
Yours sincerely,
Prof. JA Knottnerus
Office address                                                           Postal address
Parnassusplein 5                                                         PO Box 16052
2511 VX The Hague                                                        2500 BB The Hague
Telephone +31-(0)70-3407327                                              Telefax +31-(0)70-3407523
E-mail:   pw.van.vliet@gr.nl                                             www.gr.nl
</pre>

====================================================================== Einde pagina 73 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 74 ======================================================================

<pre></pre>

====================================================================== Einde pagina 74 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 75 ======================================================================

<pre>The use of reporter genes for mutagenicity
testing in animals
to:
the Minister of Health, Welfare and Sport
the State Secretary of Housing, Spatial Planning and the Environment
No. 2005/01, The Hague, January 24, 2005
</pre>

====================================================================== Einde pagina 75 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 76 ======================================================================

<pre>The Health Council of the Netherlands, established in 1902, is an independent scientific
advisory body. Its remit is “to advise the government and Parliament on the current level
of knowledge with respect to public health issues...” (Section 21, Health Act).
     The Health Council receives most requests for advice from the Ministers of Health,
Welfare & Sport, Housing, Spatial Planning & the Environment, Social Affairs &
Employment, and Agriculture, Nature & Food Quality. The Council can publish advi-
sory reports on its own initiative. It usually does this in order to ask attention for devel-
opments or trends that are thought to be relevant to government policy.
     Most Health Council reports are prepared by multidisciplinary committees of Dutch
or, sometimes, foreign experts, appointed in a personal capacity. The reports are avail-
able to the public.
             The Health Council of the Netherlands is a member of INAHTA, the international network of
             health technology assessment (HTA) agencies that promotes and facilitates information
             exchange and collaboration among HTA agencies.
This report can be downloaded from www.healthcouncil.nl.
Preferred citation:
Health Council of the Netherlands. The use of reporter genes for mutagenicity testing in
animals. The Hague: Health Council of the Netherlands, 2005; publication no. 2005/01.
all rights reserved
ISBN: 90-5549-552-2
</pre>

====================================================================== Einde pagina 76 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 77 ======================================================================

<pre>    Contents
    Executive summary 79
1   Introduction 85
1.1 Question posed and Committee 85
1.2 Account 85
1.3 Layout of the advisory report 86
2   Testing for mutagenicity 87
2.1 Effect on genetic material 87
2.2 Detecting changes in DNA 88
2.3 New mutagenicity assays 89
3   Results of new assays 91
3.1 Selection of assay systems 91
3.2 The classification of substances on the basis of classical assays 93
3.3 Results of new assays 94
3.4 Unusual features in the assay’s design 95
3.5 Assay performance and reproducibility of assay results 97
    Contents                                                             77
</pre>

====================================================================== Einde pagina 77 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 78 ======================================================================

<pre>4   Conclusions and recommendations 99
4.1 Reliability 100
4.2 Viability for risk assessment 103
4.3 Recommendations regarding further validation and standardisation 104
4.4 Recommendations for inclusion in the current testing strategy 107
    Literature 109
    Annexes 123
A   Request for advice 125
B   Committee 127
C   List of concepts 129
D   Summary of substances and their test results 131
78  The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 78 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 79 ======================================================================

<pre>Executive summary
Request for advice regarding new assay method
Chemical substances capable of modifying the body’s genetic material (DNA) possess
genotoxic properties. Mutations are irreversible changes to DNA. Such changes can
affect any of the various types of cells in the body, and can lead to cancer. In addition,
mutations in germ cells can also be transmitted to future generations. Assays for geno-
toxic properties in chemical substances form the basis for measures aimed at reducing
these risks.
     Genotoxicity can be established using a variety of assays. Mutagenicity assays are
particularly important, as they can identify changes in DNA. Using in vivo assays,
experimental animals are exposed to the substance under investigation. In vitro assays
involve the use of cells or microorganisms. If in vitro and in vivo assays produce contra-
dictory results, then more weight is usually given to the experimental animal results,
since these organisms more closely resemble human beings. Indirect evidence is also
taken into account when reaching a verdict with regard to genotoxicity. This can relate
to (in vitro or in vivo) assays of the formation of DNA adducts (covalent bonding to
DNA). In this advisory report, the in vivo data is similarly conclusive, therefore ‘geno-
toxic’ (or ‘non-genotoxic’) really means ‘genotoxic in vivo’ (or ‘non-genotoxic in
vivo’).
     Mutagenicity can manifest itself in the form of chromosomal abnormalities and
gene mutations. These occur if DNA repair has not taken place prior to cell division.
There are standardised, practical in vitro genotoxicity assays for chromosomal abnor-
Executive summary                                                                          79
</pre>

====================================================================== Einde pagina 79 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 80 ======================================================================

<pre>   malities, gene mutations, and DNA repair. The first two are mutagenicity assays, while
   the latter is used to determine indirectly whether or not a substance is genotoxic. Fur-
   thermore, these assays have in vivo counterparts, which are used to investigate chromo-
   somal abnormalities and DNA repair. However, there is as yet no standardised, practical
   in vivo assay for gene mutations.
        Nevertheless, new in vivo assays have been developed to identify substances capa-
   ble of causing gene mutations. The new assays detect gene mutations using reporter
   genes. This means that the assay focuses on gene mutations in a particular gene (where a
   genetic characteristic is encoded), rather than on the entire DNA content of the cell. The
   reporter genes are either endogenous in origin (i.e. present in the natural situation) or
   transgenic (i.e. obtained from another species and introduced into the endogenous DNA
   via genetic modification).
        The Minister of Health, Welfare and Sport has asked the Health Council of the
   Netherlands whether these new gene mutation assays with animals are suitable for use in
   the routine safety testing of chemical substances. A Health Council committee has
   assessed the question of whether such assays can be used to fill the above-mentioned
   gap in the safety testing of substances. The Committee consulted several Dutch and for-
   eign experts from outside the Health Council while preparing its advisory report.
   The Committee’s procedures
   In order to assess whether mutagenicity assays using reporter genes in experimental ani-
   mals deliver reliable results, the Committee has compared results from the new assays
   with the conclusion derived from the previously described classical genotoxicity studies.
   Where the results are in agreement, this indicates the new assay’s ability to determine
   whether or not a substance is genotoxic.
        The Committee has restricted itself to verdicts on assays in experimental animals,
   using two different transgenic reporter genes. This is because these are the only assays
   in which the published test results are derived from a sufficiently large number of sub-
   stances to enable sound conclusions to be drawn concerning assay characteristics such
   as sensitivity (chance of a genotoxic substance achieving a positive score) and specific-
   ity (chance that a non-genotoxic substance will achieve a negative score).
        Published assay results derived from a sufficiently large number of substances are
   only available via Medline for the following experimental animals with transgenic
   reporter genes: Big Blue® rat and mouse strains, and the Muta™Mouse mouse strain.
   Assay results are available for a total of 64 genotoxic and non-genotoxic substances.
   However, the assay procedures showed considerable variation. They differ, for instance,
   in terms of the level and duration of exposure, and in terms of the organs analysed.
80 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 80 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 81 ======================================================================

<pre>Verdict concerning the reliability of the new assays
On the basis of the assay results, the Committee concludes that assays using reporter
genes in the selected rat and mouse strains are, in theory, suitable for the investigation of
substances’ ability to cause gene mutations. However, the assays are not yet sufficiently
reliable for routine use. Firstly, the data cannot be used to derive a standard protocol,
setting out broad outlines of the way in which the assay must be performed. Further-
more, while the assay characteristics sensitivity and specificity are high, support for the
figures in question is inadequate. Therefore, the figures are provisional.
     This is because the substances on which the figures are based are not representative.
Relatively few non-genotoxic substances have been tested. In addition, within the group
of substances designated as genotoxic, there is a preponderance of highly genotoxic sub-
stances. Accordingly, the Committee is only able to assign an indicative value to calcu-
lated assay characteristics such as sensitivity and specificity. Furthermore, the
reproducibility of positive and negative results has been insufficiently investigated.
     The assay characteristics give the Committee no reason to suppose that the above-
mentioned rat and mouse strains differ from one another in terms of their suitability for
distinguishing substances which are genotoxic from those that are not.
     Both false negative and false positive results have been obtained. The false negative
results may have been generated by the way in which the assay is performed, for
instance, either the exposure time or expression time may be too short. Alternatively, if
the method’s degree of sensitivity is relatively low, this might account for these find-
ings. Both explanations are indicative of failure on the part of the new assay.
     In the case of false positive scores, the Committee feels that these can be explained
in terms of deficiencies in the assay methods which were used as a standard. The new
assay systems make it possible to determine whether substances are capable of inducing
gene mutations in vivo. This is not possible using the methods with which they are being
compared. The Committee therefore assumes that the substances in question are indeed
genotoxic, but they are not identified as such by the usual in vivo assays. It recommends
that, while a positive score using the new assay systems should provisionally be consid-
ered an indication of genotoxic properties, a negative score cannot be taken as proof that
the substance in question has no such properties.
     The false negative scores obtained for the reproductive organs form a separate case.
The assay systems are unable to test substances for mutagenicity in germ cells at certain
stages of maturation. There is a technical reason for this. When using reporter genes, it is
not possible to demonstrate mutagenic action in the stages following meiosis (reduction
division). Substances which are only mutagenic in these stages therefore score negative
in germ cells.
Executive summary                                                                             81
</pre>

====================================================================== Einde pagina 81 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 82 ======================================================================

<pre>   Verdict regarding viability in routine safety testing
   In vivo assay systems using transgenic reporter genes are highly flexible. They differ
   from the existing, standardised in vivo assay systems in that, theoretically, cells in any
   type of organ can be investigated. However, germ cells at an advanced stage of develop-
   ment in the reproductive system are an exception. This permits a tailor-made approach,
   in which the assay’s design can be attuned to previous toxicological findings with regard
   to the substance in question. This reduces the risk of false negative results. However, the
   term ‘routine use’ presupposes the existence of a standard protocol. The Committee
   feels that the available data does not support the drafting of a protocol of this kind at the
   present time.
        The Committee concludes that it is not (yet) appropriate to standardise the use of
   assay systems based on the transgenic animals referred to above. However, the Commit-
   tee does feel that the situation is sufficiently well understood for the use of these assay
   systems to be permitted on an ad hoc basis, provided that the test design is well substan-
   tiated. The procedure must therefore be geared to existing knowledge concerning the
   toxicity of the substance to be investigated. Aside from germ cells at an advanced stage
   of development, cells from any type of organ or tissue can be investigated.
   Recommendations for further research
   We must wait and see whether or not it will ultimately be possible to perform the assays
   with greater reliability and in accordance with a standard protocol or, in any event, with
   smaller procedural variations. The Committee makes some suggestions regarding an
   assay design which can bring the realisation of that objective closer. Initially, given
   components of the protocol should at least be established, e.g. which organs should be
   analysed in association with which exposure route. Not only does this diminish the dif-
   ferences in assay design to some degree, it also makes the protocol applicable to a wide
   range of substances whose safety has not been fully investigated, if at all. In the case of
   substances for which data is available that might open up additional avenues in terms of
   assay design, it should remain possible for the time being to depart from this in order to
   better attune assay design with the data in question. For the time being, therefore, the
   procedure used should always be properly explained by the researcher. The Committee
   believes that the protocol can best be developed within the framework of the OECD.
   This is because the results of assays carried out in accordance with OECD protocols are
   recognised by all members of the OECD.
        It is also vital that more substances be assayed, in order to increase the reliability of
   the assay systems. In this connection, the Committee is considering substances which
82 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 82 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 83 ======================================================================

<pre>have been shown to be mildly genotoxic. They are also considering the use of sub-
stances which have been identified as being non-genotoxic. This is because these two
categories lag far behind in terms of numbers.
Recommendations for inclusion in safety testing
In vivo assays using transgenic reporter genes can demonstrate their viability as part of
the genotoxicity assaying currently required by the EU. The EU requires a dossier con-
taining standard toxicological data supplied by the manufacturer or the party which uses
the substance for commercial purposes or which is placing it on the market. In the geno-
toxicity section, the results are requested of in vitro and in vivo assays which have been
carried out step by step. In addition to production volume, it is the use to which the sub-
stance in question is to be put (e.g. crop protection) which determines exactly which
genotoxicity assays are permitted or required in each of the various steps.
     Despite these differences in terms of testing strategy, the Committee believes that
the possibility of using the new assay systems across all policy areas involving sub-
stance regulation to be worthy of consideration. The assay is already permitted in a few
of these areas, provided that there is a well-supported assay design. The Committee rec-
ommends that the assay be approved for use in the remaining areas, subject to the same
conditions.
     While the assay is a valuable addition to the current testing repertoire, it is laborious
and time-consuming in comparison to the established assays. Furthermore, there is no
standardisation, which is a major precondition for validation. The Committee therefore
feels that, for the time being, it is suitable as an ad hoc supplement to the current assays.
Executive summary                                                                              83
</pre>

====================================================================== Einde pagina 83 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 84 ======================================================================

<pre>84 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 84 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 85 ======================================================================

<pre>Chapter 1
        Introduction
1.1     Question posed and Committee
        Mutagenicity assays are a standard feature of procedures to determine whether chemical
        substances have hazardous properties 1-3. Mutagenicity assays detect changes to the
        genetic material which occur following exposure to these substances. These changes can
        produce effects such as the development of cancer.
             Els Borst, the former minister of Health, Welfare and Sport requested advice from
        the Health Council of the Netherlands concerning the usefulness of a new type of
        mutagenicity assay (see Annex A). Rather than investigating an organism’s entire com-
        plement of DNA, assays of this type just focus on part of it – the so-called reporter
        genes.
             The President of the Health Council has asked the Committee on the Evaluation of
        the Carcinogenicity of Chemical Substances – referred to in this report as ‘the Commit-
        tee’ – to respond to this request for advice. Details of the current make-up of the Com-
        mittee are set out in Annex B.
1.2     Account
        Published material found during on-line searches in PubMed (Internet: http://
        www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) form the scientific basis of the advisory
        report. The key words used during these searches were ‘mutagens’, ‘mutagenicity tests’,
        ‘knockout mice’, ‘reporter genes’ and ‘genetically modified animals’. From the result-
        Introduction                                                                             85
</pre>

====================================================================== Einde pagina 85 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 86 ======================================================================

<pre>    ant list, review articles were selected which included an examination of the method’s
    viability for routine toxicological testing. Where necessary, literature sources cited in
    these publications were consulted. Other documents examined included a review report
    by RIVM and TNO, as well as recent publications not covered by the reviews. The liter-
    ature survey was terminated on 15 October 2004. The Committee consulted several
    Dutch and foreign experts from outside the Health Council while preparing its advisory
    report.
         The definitions of genotoxicity and mutagenicity, the advisory report’s key con-
    cepts, were based on international agreements. Previously, the Committee used its own
    definitions 2,3. However, it now prefers to use concept definitions which have been
    agreed by international consensus. The OECD and the WHO’s International Programme
    on Chemical Safety use a common list of concepts for risk assessment 4. However, the
    concepts mentioned above do not appear in this list. The United Nations’ Globally Har-
    monized System for Classification and Labelling of Chemicals is also incomplete 5. The
    Committee has therefore decided to adopt the EU’s definitions of genotoxicity and
    mutagenicity.
1.3 Layout of the advisory report
    The structure of the advisory report is as follows. Section 2 contains background infor-
    mation concerning mutagenicity and the assay methods for detecting it. Section 3 con-
    tains a description of new mutagenicity assays using reporter genes. It also provides a
    summary of what is currently known regarding the following assay characteristics: sen-
    sitivity, specificity and predictive value. Next, in section 4, the viability of the new type
    of mutagenicity assays for routine investigations is assessed. Recommendations are
    made for further validation, standardisation, and inclusion in the EU’s safety policy for
    chemical substances. This then is the response to the request for advice.
86  The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 86 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 87 ======================================================================

<pre>Chapter 2
        Testing for mutagenicity
2.1     Effect on genetic material
        Changes to an organism’s DNA, it’s genetic material, are potentially detrimental. While
        they can occur spontaneously, such changes can also be produced by certain chemical
        substances and some types of radiation. These agents are therefore described as geno-
        toxic. They possess the ability to induce potentially harmful changes to an organism’s
        DNA 6.
            Changes to DNA are reversible until the DNA is replicated prior to cell division.
        This is because, up until that moment, the changes can be reversed by DNA repair
        enzymes. If these repairs are not carried out prior to DNA replication, then the changes
        become irreversible. Following cell division, they are passed on to the daughter cells.
            Irreversible changes to DNA are referred to as mutations. The Committee under-
        stands this to mean a permanent, transmissible change in the amount or structure of
        genetic material within cells or organisms 6. In all types of body cells, mutations in the
        DNA can lead to cancer. Furthermore, mutations in germ cells can be passed on to suc-
        ceeding generations.
            A substance is described as a mutagen if an assay demonstrates that it has the ability
        to cause mutations. Substances of this kind are, by definition, genotoxic. However,
        genotoxicity can reveal itself by the formation of DNA adducts (covalent bonding to
        DNA), for example. This is an indirect indication that the substance is capable of dam-
        aging DNA.
        Testing for mutagenicity                                                                   87
</pre>

====================================================================== Einde pagina 87 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 88 ======================================================================

<pre>         The question of whether or not substances possess genotoxic properties is also
    important in terms of policy. It is assumed that genotoxic substances have no threshold
    level of exposure beneath which no adverse health effects are to be expected 2,3. Non-
    genotoxic substances on the other hand are assumed to have such a threshold. The clas-
    sification of substances into ‘genotoxic’ and ‘non-genotoxic’ is therefore one of the pil-
    lars of substance policy at national and EU level.
         Genotoxicity is a strong indication that the substance in question is also carcino-
    genic. Thus, if a substance has been shown to be genotoxic, this can be a reason to skip
    assays for carcinogenicity and to prohibit further use of the substance. If the substance is
    difficult to replace, then assays for carcinogenicity go ahead anyway. In the event that
    these yield a positive result, then a risk assessment is carried out in order to establish an
    upper exposure level. It is not possible to identify all cancer-causing substance via their
    genotoxic properties. This is because the carcinogenicity of some substances is based on
    mechanisms other than that of changing the genetic material. These are non-genotoxic
    carcinogens.
         Specific government measures are taken in response to evidence of genotoxicity in
    the germ cells. Accordingly, the use of a substance in consumer products is prohibited if
    it has been shown to be both mutagenic and capable of reaching the reproductive organs
    of individuals who have been exposed to it 7. Nor is use for this purpose permitted if
    mutagenicity has been demonstrated in germ cells.
2.2 Detecting changes in DNA
    Researchers detect the genotoxic action of a substance by means of genotoxicity assays.
    These assays fall into two groups: assays to demonstrate mutagenicity and assays to
    detect variables other than mutations. One example of the latter group is an assay for
    Unscheduled DNA Synthesis (UDS). This detects DNA repair synthesis, which is indi-
    rect evidence of genotoxicity.
         There are many types of assays for establishing mutagenicity: in vitro, using cells or
    micro-organisms, and in vivo, using experimental animals. If necessary, the assays can
    be performed in a series of individual steps. This means that, following a limited number
    of assays, the decision can be taken to suspend the testing of a substance. This would be
    the case if the results showed the substance to be genotoxic and, as a result, it was
    decided that the substance should either not be used or that it should be withdrawn from
    use. If in vitro and in vivo assays produce contradictory results, then more weight is usu-
    ally given to the latter, since these more closely reflect the situation in human beings 2.
    The reason for this is that, in the latter case, experimental animals are exposed rather
    than just human or animal cells, or microorganisms. This can highlight substances
    which, although not genotoxic, can nevertheless be converted into genotoxic metabo-
88  The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 88 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 89 ======================================================================

<pre>    lites. This occurs mainly in the liver. In addition, body cells can be exposed in a physio-
    logical manner.
         Different mutagenicity assays target different types of mutations. Mutations can be
    classified into gene mutations and chromosomal abnormalities 2. Gene mutations
    involve changes within a gene*, such as base-pair substitutions (the replacement of
    DNA base pairs by other base pairs) and minor deletions (the loss of sections of DNA).
    Chromosomal abnormalities are the result of breaks in the chromosomes or of the faulty
    distribution of chromosomes among daughter cells during cell division.
         In the case of a small number of mutagenicity assays, the EU (in the context of its
    substance policy) has set out protocols in the form of guidelines, virtually all of which
    have been adopted from the OECD. The results of assays carried out in accordance with
    such OECD protocols are recognised by all members of the OECD. These include the
    member states of the EU, the US, Canada, Australia and Japan. There are OECD guide-
    lines governing various in vitro assays for gene mutations and chromosomal abnormali-
    ties. There are also guidelines for a few in vivo assays, such as the micronucleus assay,
    which detects chromosome breaks and deletions, and the above-mentioned assay for
    UDS.
         As yet, however, there are no standardised in vivo assays for gene mutations. One
    exception is the spot test**, but this is not very popular as it requires large numbers of
    experimental animals. The UDS assay is often performed instead. The assays which
    form the subject of this advisory report appear capable of filling the gap, with regard to
    the in vivo assay for gene mutations. They are introduced in the following subsections,
    after which their performance is addressed in section 3. In section 4, a view is expressed
    concerning their viability for risk assessment.
2.3 New mutagenicity assays
    There is a range of new in vivo assays, using rats and mice, for demonstrating the pres-
    ence of gene mutations. A summary of these assays was published in a recent RIVM/
    TNO report 8. A characteristic feature of these assays is that a specific gene, the reporter
    gene, is investigated for the presence of mutations, rather than the entire DNA content of
    the cell. Depending on the type of reporter gene used, these assays can be divided into
    two groups, both of which are discussed here. One type of assay makes use of endoge-
    nous reporter genes, which are naturally present in the experimental animals. The other
    type uses foreign (transgenic) reporter genes, which have been introduced into the nor-
    mal DNA via genetic modification.
*   carrier of a genetic characteristic
**  gene mutations are detected as fur spots of changed colour
    Testing for mutagenicity                                                                     89
</pre>

====================================================================== Einde pagina 89 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 90 ======================================================================

<pre>   Endogenous reporter genes
   Assays based on endogenous reporter genes generally involve genes that code for the
   enzymes hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT), thymidine kinase (TK) and
   adenosine phosphoribosyltransferase (APRT). The detection of mutations is based on a
   loss of enzyme function resulting from the mutation.
        The HPRT gene is located on the X chromosome. Since male and female cells both
   contain one active allele, normal, non-genetically modified rat or mouse strains can be
   used for the purposes of detection. The TK and APRT genes on the other hand are not
   located on the sex chromosomes. In the case of these genes, both alleles are active. Since
   mutations in these genes are subject to recessive inheritance, the knockout technique
   was used to create mouse strains which have only one of the two active alleles in each of
   their cells. These strains can also be used to detect mutations through the resultant lack
   of active enzyme. Such cases involve both an endogenous reporter gene and genetic
   modification of the experimental animals.
        Mutation frequency is defined as the number of mutations per copy of the reporter
   gene. This is determined using organs or tissues whose cells can be cultured, such as the
   spleen. To this end the cells are cultured on a medium which incorporates a substrate
   that is converted into a toxic product by the enzyme (HPRT, TK or APRT). Cells in
   which mutations have occurred do not produce the enzyme and are therefore able to sur-
   vive, unmutated cells do produce the enzyme and die as a result.
   Transgenic reporter genes
   The other type of assay uses rat and mouse strains incorporating a transgenic reporter
   gene of bacterial origin. This gene is present in every cell of the animal’s body. In order
   to determine the mutation frequency, all of the DNA in an organ or tissue is isolated.
   Next, the reporter gene is isolated and ‘packaged’ in a bacteriophage or plasmid. This
   package is then introduced into a bacterial strain which lacks the reporter gene in ques-
   tion. The bacteria are then subjected to a colour test in which only those bacteria with a
   mutated reporter gene become coloured (alternatively only cells with no such mutation
   become coloured). They can also be introduced to a nutrient medium in which only
   mutants can survive. Since DNA can be obtained from any organ, this variant is not
   restricted to certain types of tissue.
        The most popular strains for this type of assay are the Muta™Mouse (MM) mouse
   strain, which incorporates the lacZ reporter gene, and the Big Blue® mouse and rat
   strains (BB), which carry the lacI reporter gene.
90 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 90 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 91 ======================================================================

<pre>Chapter 3
        Results of new assays
        Data from the available scientific literature indicate the extent to which substances with
        and without genotoxic properties can be identified using the new mutagenicity assays
        based on reporter genes. This is because the results obtained for these two groups of sub-
        stances in the assays in question can be compared with those in classical studies of geno-
        toxicity. In this section, before discussing the findings obtained using this approach, the
        Committee will explain how it selected reporter-gene assay systems for assessment.
3.1     Selection of assay systems
        Each of the assay systems (using either naturally occurring or introduced reporter genes)
        has its pros and cons. In the case of endogenous reporter genes, one can only examine
        those organs whose cells can be cultured. On the other hand, it has the advantage of a
        low frequency of spontaneous mutations.
             The major advantage of transgenic systems is that, in theory, any organ or organ
        system can be analysed. However, they do differ in terms of the ease with which DNA
        can be extracted and the quantities of the reporter gene that can be obtained. Freedom of
        choice with regard to organs can be important if, on the basis of prior knowledge of a
        substance, one wants to focus on particular organs.
             The main drawback of transgenic systems is their high number of spontaneous
        mutations per copy of the reporter gene (multiple copies of which are present in every
        cell of the animal’s body). This can, perhaps, best be explained as follows. In transgenic
        systems, the mutation frequency is ultimately measured in bacteria. However, reporter
        Results of new assays                                                                       91
</pre>

====================================================================== Einde pagina 91 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 92 ======================================================================

<pre>   genes can undergo further mutation following their insertion into the bacterial cell 9,10.
   This could account for the fact that the spontaneous mutation frequency is higher in
   transgenic systems than in endogenous systems, which do not need the bacterial step. It
   may be that, as a result, the former detect a lower percentage of genotoxic substances
   than the latter. However, this possibility has yet to be investigated.
        Although they are more time consuming and labour intensive than the usual in vivo
   mutagenicity assays, the Committee considers the new reporter-gene methods to be a
   very promising means of investigating the genotoxic properties of substances. All of the
   variants are, in theory, suitable for this purpose. There are no scientific grounds for
   excluding certain variants.
        Nevertheless, the Committee has not assessed every single genetically modified rat
   and mouse strain that could be used in a gene mutation assay. It discusses only those
   assay results for genetically modified rat and mouse strains in which the number of sub-
   stances tested is sufficiently large to enable sound conclusions to be drawn. This was
   found to apply only to the transgenic MM and BB. In this regard, assay results are avail-
   able for approx. one hundred substances 11-13. For the purposes of this advisory report,
   BB and MM include the commercially available strains and the parental lines from
   which they are descended. Various review articles discuss their significance in terms of
   detecting carcinogenic properties 11,13. However, the Committee has focused on geno-
   toxic properties. The reason for this is that the assay systems detect mutagenicity, yet
   there is not a one-to-one relationship between carcinogenicity and (this form of) geno-
   toxicity. After all, there are also non-genotoxic carcinogens.
        In addition, the Committee has restricted the number of substances on which it bases
   its conclusions. Assay results for about one hundred substances are available 11-13. For
   the purposes of reaching a verdict, however, the Committee has limited itself to those
   substances for which both the design and results of the assay used are reported in litera-
   ture available via Medline. This was also conditional upon the assay in question being
   adequately performed and reported. Mixtures and ionising radiation were not taken into
   consideration.
        Finally, the assessment was limited to the lacI and lacZ genes of BB and MM,
   respectively. The foreign DNA of BB and that of the MM variant in which a bacterioph-
   age was used as the vector contains yet another reporter gene, namely cII. The Commit-
   tee did not take this gene into consideration, however, since it has been tested for gene
   mutations with only fifteen substances. The equivalent number for lacI and lacZ is at
   least forty.
92 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 92 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 93 ======================================================================

<pre>3.2 The classification of substances on the basis of classical assays
    Annex D summarises the 85 substances used by the Committee to test the reliability of
    the new reporter gene assay systems. The table illustrates results obtained using tradi-
    tional assays for genotoxicity, carcinogenicity, in addition to the results of assays with
    the BB and MM experimental animal strains. Details of in vitro, in vivo and total geno-
    toxicity are included. In this overall verdict, as previously explained, more weight is
    given to the in vivo results. A final verdict of ‘genotoxic’ (or ‘non-genotoxic’) is there-
    fore synonymous with ‘genotoxic in vivo’ (or ‘non-genotoxic in vivo’). The verdict on
    whether or not a substance is genotoxic, is not only based on its scores* in conventional
    genotoxicity tests. This verdict also includes the results of studies which provide indirect
    information about its possible genotoxic properties. This can, for example, involve stud-
    ies into the formation of DNA adducts.
         The verdict on genotoxicity serves as a criterion for the performance of BB and MM
    assay systems for mutagenicity. It was derived from previous Health Council advisory
    reports or reports produced by the Dutch Expert Committee on Occupational Standards,
    which was set up by the Ministry of Social Affairs and Employment and which became
    part of the Health Council in 1995. In its absence, the conclusion is based on a mono-
    graph by the ‘International Agency for Research on Cancer (IARC)’ in Lyon. If, in this
    case also, no such document is available, then the verdict is based on the original publi-
    cations. If an IARC document is available, then, in addition to the score, the ‘carcinoge-
    nicity’ column also sets out the evidential value of findings which suggest that the
    substance in question is indeed a carcinogen.
         Some of the review documents consulted were published some time ago. In most
    cases this is not a problem, since these are publications which establish the existence of
    genotoxic properties. The verdict of ‘genotoxic’ would not be revised by more recent
    reports. In the remaining cases, recent literature was consulted for additional (in vivo)
    data. This was the case with 4-aminobiphenyl, 2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole, asbes-
    tos, 4-chloro-o-phenylenediamine, isopropyl methanesulphonate (IPMS), 7-methoxy-2-
    nitronaphtho[2,1-b]furan, 2-nitro-p-phenylenediamine, and quinoline. If the substance’s
    in vivo genotoxicity has either not been fully investigated or not investigated at all, then
    there is no final verdict and it is placed in the catch-all residual category.
         The following three groups have therefore been identified: genotoxic substances,
    non-genotoxic substances, and a residual group. The latter group accommodates those
    substances for which, as a result of gaps in the data, no conclusions can be reached on
    whether they possess genotoxic properties. On the basis of the outlined criteria for geno-
*   positive means mutagenic/genotoxic, negative is non-mutagenic/non-genotoxic
    Results of new assays                                                                        93
</pre>

====================================================================== Einde pagina 93 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 94 ======================================================================

<pre>    toxicity, the Committee has found 52 substances to be genotoxic, and 12 as non-geno-
    toxic. They were unable to classify a further twenty-one substances.
3.3 Results of new assays
    Performance of the assays and interpretation of the results
    The assays were performed in a variety of ways. For instance, exposure varied in terms
    of route, schedule and level. They also differed, for example, in terms of expression time
    (the interval between the end of animals’ period of exposure and the moment at which
    they were sacrificed and their organs were removed). There were also differences in the
    types of organs investigated. For instance, the number of organs examined varied from
    one to eleven. Furthermore, the number of animals per group varied from two to ten.
         Annex D does not depict the differences in assay design, with the exception of the
    organs investigated. The results, which are reported organ by organ, are expressed in
    terms of the mutation frequency in treated animals divided by that in control animals.
    This quotient varies from 0.5 to 90. The substances therefore score from negative to
    very highly positive. Corresponding organs from the various animals in a group are usu-
    ally analysed separately, after which the results are subjected to statistical analysis.
    However, in some cases these are pooled prior to analysis, or there is no information to
    show how the researchers reached their final conclusions. In such instances, certainly
    where quotients of up to about two are involved, it is not possible to determine whether
    the rise in question is real or not. The Committee views values of up to two as not ele-
    vated, unless they are found to be statistically significant.
         The results of the assays in BB and MM were obtained as follows. A substance is
    considered to be genotoxic in a given organ (or tissue) if it increases the mutation fre-
    quency relative to the control group. The substance is assigned a positive score if, at any
    dose, duration, etc., it produces an elevated mutation frequency in at least one of the
    organs (or tissues) studied. The score is negative if no extra mutations occurred in any of
    the organs tested. Under BB, an indication is given of whether rats or mice were used for
    the assay.
    Assay results for genotoxic substances
    What are the results of the new assays in terms of detecting genotoxicity? Forty-nine of
    the fifty-two genotoxic substances scored positive. Thus, despite the wide range of assay
    designs, in virtually all cases genotoxic substances are identified as such. The three
    genotoxic substances with negative scores (arsenic trioxide, methyl bromide, and hydra-
    zine sulphate) were tested in four, three and two different types of organ respectively. Of
94  The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 94 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 95 ======================================================================

<pre>    the other 49 substances, well over half were tested more than once. Most of these show
    consistently positive scores. Six produced contradictory results however. These were
    acrylamide, aflatoxin, cyclophosphamide, ethyl methanesulphonate (EMS), N-hydroxy-
    2-acetylaminofluorene, and methyl methanesulphonate (MMS).
         Various substances in this group are highly genotoxic. Some of these were also
    found to be highly positive in various organs of BB or MM animals. A few are now in
    use as positive controls. As a result, more than the usual number of assay results are
    available for these substances. N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) is an example of the latter.
    Assay results for non-genotoxic substances
    How good are the new assay systems at identifying non-genotoxic substances? Seven of
    the twelve non-genotoxic substances produced negative scores. Five produced positive
    scores. The latter group includes phenobarbital, which has been assayed on four occa-
    sions. In three of these assays it tested negative, and on one occasion it tested (weakly)
    positive. Methyl clofenapate and tetrachloromethane have been repeatedly assayed.
    Both proved to be negative in two different assays.
3.4 Unusual features in the assay’s design
    Selection of organs
    The distinctive characteristic of the BB and MM experimental animal strains is that they
    enable researchers to select specific organs for analysis. This is reflected in the wide
    range of organs that has been investigated. When selecting a given organ, various fac-
    tors have to be taken into account, such as mode of administration. Inhalation tests, for
    instance, would in any event involve an investigation of the lungs. Another criterion, for
    example, was the opportunity to draw comparisons with standardised assays: bone mar-
    row (micronucleus assay) or liver (UDS). With carcinogenic substances, there is usually
    an investigation of those organs in which the substance in question is known to induce
    tumours. This applies to both genotoxic and non-genotoxic carcinogens.
         Non-target organs have also been studied, however. In the non-genotoxic substances
    tested, the tumours generally arise in the liver. Accordingly, in this group, this organ has
    been more frequently investigated than any other. In general, genotoxic substances are
    capable of inducing tumours in a range of different organs. On average, therefore, more
    types of organs have been investigated in this category. Therefore, to a large extent, the
    organs analysed mainly reflect the existing knowledge of the substance in question.
         As a result of the considerable variation in the organs investigated, no general con-
    clusions can be drawn from the organ scores.
    Results of new assays                                                                        95
</pre>

====================================================================== Einde pagina 95 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 96 ======================================================================

<pre>   Detection in germ cells
   Among the organs investigated, a special place is reserved for the reproductive organs,
   since mutations in germ cells can be passed on to succeeding generations. Evidence that
   a substance is mutagenic in germ cells therefore leads to more stringent restrictions on
   its use than is the case when mutagenicity is detected in other cell types.
        The enormous number of cell divisions involved in the production of male germ
   cells means that these cells are more appropriate for investigating the mutagenic charac-
   teristics of substances than are female germ cells. For this reason, when investigating the
   effect of a variety of substances on mutation frequency, the reproductive organs of male
   animals were used. The mutation frequency was determined either in the testis and epid-
   idymis, or in sperm ducts, or sperm obtained from them. These preparations contain
   varying proportions of germ cells and connective tissue (stroma). For the purposes of
   safety, the Committee dealt with the results obtained using these preparations as if they
   had been derived from germ cells.
        The substances investigated include established mouse germ cell mutagens such as
   ENU, EMS, IPMS, MMS and MNU. These substances have been shown to be highly
   positive in classical in vivo genotoxicity assays targeting germ cells, such as the spe-
   cific-locus test and the dominant-lethal test (for example see 14-21).
        ENU, IPMS and MMS have been extensively tested. ENU and IPMS have always
   tested positive. In the overwhelming majority of assays, MMS has been shown to be
   negative. On only one occasion did it yield a (weakly) positive score. EMS and MNU
   have each been assayed on one occasion, and both were found to be positive. Thus one
   of the cited germ cell mutagens stands out by repeatedly yielding negative scores.
   Detection in experimental animal strains, BB versus MM
   Seventeen genotoxic substances have been assayed in both BB and MM. In only one
   case, that of N-hydroxy-2-acetylaminofluorene, did the two assay systems yield differ-
   ent results (positive in BB, negative in MM).
        Of the non-genotoxic substances, three have been assayed in both species of ani-
   mals. Two were consistently negative. The third, phenobarbital, was negative in BB, but
   (weakly) positive in one of the two assays carried out using MM. The mutation fre-
   quency was 1.4 times normal, which, in this case, was statistically significant.
96 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 96 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 97 ======================================================================

<pre>    Detection in BB rats versus BB mice
    Five genotoxic substances were assayed in BB rats and mice. Of these, four scored pos-
    itive in both species. The fifth, aflatoxin, proved to be positive in rats and negative in
    mice.
         No non-genotoxic substances have been assayed in both systems.
3.5 Assay performance and reproducibility of assay results
    Assay performance
    The Committee has analysed the assay characteristics of sensitivity, specificity, and pos-
    itive and negative predictive value for BB rats and mice. It performed an identical but
    separate analysis for MM. Sensitivity refers to the chance of a genotoxic substance
    yielding a positive score, while specificity is the chance that a non-genotoxic substance
    will yield a negative score. A high degree of sensitivity means that there are few false
    negative results, while a high-degree of specificity means that there are few false-posi-
    tive results. The positive predictive value is the chance that a substance which yields a
    positive score is indeed genotoxic. Finally, the negative predictive value is the chance
    that a negative score means that the substance is not genotoxic.
         The assay characteristics are summarised in table 1. The Committee felt that the
    numbers were too small for separate calculations to be made for BB rats and BB mice.
    For this reason, the BB data for rats and mice was pooled. A number of substances were
    assayed on several different occasions, and the results were found to be contradictory.
    Since all but one of these substances are genotoxic, assay performance associated with a
    ‘positive’ final verdict should be substantially more favourable than in cases resulting in
    a verdict of ‘negative’. Accordingly, when drawing up the table, calculations were made
    using both sets of results. For this reason, the results of the individual assays were not
    processed separately. This would have meant that substances which had been frequently
    tested would have a disproportionate influence. Substances with ten or more scores are
    all genotoxic, furthermore the assay characteristics are already dominated by genotoxic
    substances as a group.
         The table shows that the BB and MM test systems are characterised by a high degree
    of sensitivity and a reasonably high degree of specificity. In addition, assays using these
    animals have a high positive predictive value. On the other hand, their negative predic-
    tive value exhibits considerable variation. Where there are contradictory assay results,
    the nature of the final score influences the numbers. Most percentages are somewhat
    lower in the case of ‘negative’ than in that of ‘positive’.
    Results of new assays                                                                       97
</pre>

====================================================================== Einde pagina 97 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 98 ======================================================================

<pre>Table 1 Characteristics of assays using BB and MM to identify genotoxic and non-genotoxic substances
Characteristic                                                                     Result
                                                      BB (n=43)a                                        MM (n=40)
                                              %                      fraction                    %                     fraction
                                              b
sensitivity                               100           (91)      32/32        (29/32)          89        (81)        32/36     (29/36)
specificity                                 64          (64)        7/11        (7/11)          75       (100)          3/4       (4/4)
positive predictive value                   89          (91)      32/36        (29/33)          97       (100)        32/33     (29/29)
negative predictive value                  100          (70)          7/7       (7/10)          43        (36)          3/7      (4/11)
a
     number of substances
b
     substances with contradictory assay results were scored as positive. In brackets: the same substances scored as negative
              Reproducibility of assay results
              The extent to which the substances produce reproducible scores in BB and MM has
              already been discussed. Given the differences in assay design, reproducibility here is
              used in the broadest possible sense. The Committee uses reproducibility in the strictest
              sense of the term when assays carried out using identical procedures produce matching
              results. Only one article provides information on this point.
                   Three different laboratories assayed dimethylnitrosamine, to determine whether it is
              genotoxic in the livers of BB mice and MM 22. After the various groups of animals had
              been exposed, samples of their liver tissue were sent to each laboratory for analysis. In
              all three laboratories, both assays yielded positive results.
98            The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 98 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 99 ======================================================================

<pre>Chapter 4
        Conclusions and recommendations
        Are the new types of mutagenicity assays using reporter genes viable for the assessment
        of chemical substances for genotoxicity? The literature survey in section 3 shows that
        substances which have been shown to possess genotoxic properties have been assayed in
        sufficient numbers to enable conclusions to be drawn concerning the viability of testing
        with BB and MM. To a large extent, the very fact that they are commercially available
        undoubtedly explains why so many assay results obtained using these strains have been
        published. It also explains why reviews based on the risk assessment of substances focus
        on these animals.
             In order to assess the viability of the new assays, the Committee first explores the
        issue of their reliability (subsection 4.1). The ability to produce reliable results is, after
        all, a major precondition for a viable assay. This is followed by a verdict on the assays’
        viability (subsection 4.2). The Committee then makes recommendations regarding stud-
        ies aimed at improving the assays’ viability (subsection 4.3). The section concludes with
        suggestions for their inclusion in current toxicological testing procedures (subsection
        4.4).
        Conclusions and recommendations                                                                99
</pre>

====================================================================== Einde pagina 99 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 100 ======================================================================

<pre>4.1 Reliability
    General verdict
    How reliable are results obtained using the new mutagenicity assays? In all, the results
    of assays on 64 substances (52 genotoxic and 12 non-genotoxic), were found to be suit-
    able for the purposes of reaching a verdict.
         The assays have been shown to possess high sensitivity, specificity, and positive
    predictive value (at least 64 percent). The negative predictive value is considerably
    lower (at least 36 percent). The assay performances are encouraging, given the variation
    in the procedures used. They do not suggest that the high frequency of spontaneous
    mutations in the reporter gene in any way impairs the suitability of BB and MM as assay
    systems. Indeed, such satisfactory assay performances may well be a direct result of the
    variation in assay design. After all, this is substance-specific.
         The Committee feels that, given the small number of assays carried out, little signif-
    icance can be attached to the observed differences in assay performance between BB
    and MM (or between BB rats and BB mice). In theory, the use of reporter genes should
    not lead to any differences at all. Partly for this reason the Committee feels that, for the
    time being, the two assay systems are equally well able to determine whether or not a
    substance possesses genotoxic properties.
         While rating the assay performances as satisfactory, the Committee views the fig-
    ures as provisional, mainly because the substances tested are not representative. This is
    because the percentage of genotoxic substances is disproportionately high. Furthermore,
    there is a preponderance of highly genotoxic substances within this group. This largely
    explains the satisfactory assay performances. Furthermore, the extent to which positive
    and negative results can be repeated has yet to be fully investigated.
    Explanation of false negative and false positive results
    Some genotoxic substances tested negative, and some non-genotoxic substances tested
    positive. The Committee has no evidence to suggest that the experiments in question
    were not performed correctly. Nor is it a matter of group size, since the average size of
    the groups in question was the same as in the assays that produced correct results.
    Accordingly, its explanation of the results is that they are genuinely different from those
    obtained using classical genotoxicity assays.
         In the Committee’s view, an obvious explanation for the false negative scores is that
    the substances failed to reach the organs which were examined, due to deficiencies in
    assay design. For instance, the period of exposure might have been too short. Another
100 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 100 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 101 ======================================================================

<pre>possibility is that the substances may indeed have reached the organs in question, but
that the expression time was not ideal. The observed false negative results could there-
fore be ascribed to differences in assay design, except perhaps in the cases of aflatoxin
and N-hydroxy-2-acetylaminofluorene. These two compounds both proved to be nega-
tive in mice, yet they yielded a positive score in rats. In the case of aflatoxin, it has been
established that rats are more susceptible to this substance than mice. It is not known
whether the same can be said of N-hydroxy-2-acetylaminofluorene.
     Are there any other possible explanations? Might the negative results obtained using
the new assays be due to the genotoxic substances’ mechanism of action? The Commit-
tee feels that this is not the case, since all genotoxic substances can induce gene muta-
tions to a greater or lesser extent. A previously held view was that genotoxic substances
either caused gene mutations or chromosomal abnormalities, not both. In the light of
new data, this view has become outmoded. Genotoxic substances are generally capable
of inducing both types of mutation, albeit to a different extent. It is therefore unlikely
that a negatively scoring genotoxic substance’s mechanism of action would cause it to
be overlooked by the assay system.
     The Committee is more inclined to ascribe this to a low degree of sensitivity on the
part of the assay system. As a result, genotoxic substances which induce relatively few
gene mutations yield a negative score in the assay. The results obtained for ENU, MNU,
IPMS, EMS and MMS indicate that this might well be the case. These substances are all
alkylating agents, which can produce the same type of DNA adducts and, as a result,
cause the same type of gene mutations 23,24. The first three substances produce many
mutagenic adducts per unit of DNA, the latter two considerably fewer. Another way in
which the latter two substances differ from the first three is that they do not always (or
very seldom) yield a positive score in BB and MM. This may indicate that the assay
using these animals is less sensitive than classical genotoxicity studies.
     How can the false positive assay results be explained? The explanation for non-
genotoxic substances yielding positive scores could be that these substances slipped
through the traditional assays, causing them to be incorrectly classified as non-geno-
toxic. If the target organs involved, and the results of both types of assay (traditional and
new), are taken into account, then it can be seen that this scenario is far from imaginary.
In addition, the Committee has a theoretical argument for this, namely that the new
assay systems detect gene mutations in vivo, something that was not previously possi-
ble. A positive score in these assay systems might also indicate that some substances in
the residual group in Annex D are also genotoxic, even though they have not been previ-
ously identified as such.
Conclusions and recommendations                                                                101
</pre>

====================================================================== Einde pagina 101 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 102 ======================================================================

<pre>    Significance of anomalous results
    New assay methods are usually validated against results obtained using tried and tested
    methods, which serve as a standard. This is done for lack of a better alternative. Accord-
    ingly, the validation of a new assay is usually based on a comparison with established
    assay methods. For the purposes of this advisory report, that is the entire body of par-
    tially validated and standardised mutagenicity assays and other types of assay, such as
    cohort studies of chromosomal abnormalities in peripheral blood resulting from expo-
    sure to the substance in question. There is no way of avoiding such dependence. The
    anomalous results obtained using the new assays should therefore be assessed in this
    light.
         There are two possible explanations for the anomalous results, either the result
    yielded by the classical genotoxicity assay is correct or the result obtained using the new
    assay is correct. In view of the evidential value for genotoxicity using classical genotox-
    icity assays, the Committee feels that the false negative scores can be explained in terms
    of the assay design and the choice of experimental animal. It therefore favours the first
    of these two possible explanations. The false positive scores are a different matter. The
    assay system is based on gene mutations in vivo, which involve a different end point
    than that used by classical assay systems. The Committee therefore feels that it is advis-
    able to assume that the substances in question are indeed genotoxic. Finally, the Com-
    mittee points out that the risk of obtaining an incorrect result due to chance cannot be
    excluded.
         The Committee believes that further research is required, to better understand the
    assay systems’ sensitivity and specificity. First of all, more results from non-genotoxic
    substances are needed, since these substances are presently under-represented. Most of
    the genotoxic substances assayed are either highly or very highly genotoxic. The Com-
    mittee urges that consideration also be given to mildly genotoxic substances (identified
    as marginally positive by classical assay methods).
    Explanation of poor score in reproductive organs
    The results obtained using individual substances have enabled a verdict to be reached
    concerning the possibility that BB and MM can be used to detect mutagenicity in germ
    cells. These are the previously-mentioned established mouse germ cell mutagens, which
    are all highly genotoxic. Nevertheless, with the exception of a single weakly positive
    result, a series of experiments involving one of these mutagens (MMS) yielded negative
    scores in the germ cells of BB mice and MM. These experiments cover a range of
    expression times. This is important, as the expression time determines which develop-
    mental stages of sperm will be used to assay the substance 25,26.
102 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 102 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 103 ======================================================================

<pre>          The studies revealed no deficiencies on this point, every stage was investigated. The
    poor scores could be related to the stages affected by the MMS mutagen. This is because
    this substance is known to be mutagenic only in the stages following meiosis (reduction
    division) (for example, see 16,27). This is the type of cell division in which the number of
    chromosomes is halved. The BB and MM bacterial detection system cannot be used to
    demonstrate DNA damage in post-meiotic germ cells. It relies on DNA replication fol-
    lowed by cell division. Accordingly, it can be used for all types of body cells, including
    premeiotic germ cells. Changes in the DNA of post-meiotic cells cannot be detected
    using the detection system of BB and MM. This is because no DNA replication takes
    place during this developmental stage, which means that no mutations can arise, nor can
    cell division take place. This is not a problem for a classical assay like the specific-locus
    test, since this is based on a different detection system, involving a characteristic in the
    progeny that has been changed by mutation, such as fur colour. In this instance, DNA
    replication and cell division take place after fertilisation, i.e. in the progeny.
          Unlike MMS, ENU did yield a positive score in all assays performed with BB and
    MM involving the analysis of germ cells. In the case of this substance, it has been estab-
    lished that it is mutagenic in both pre-meiotic and post-meiotic cells (for example, see
    18,19
          ). This is in agreement with the explanation of the MMS results that is outlined
    above.
    Limitations regarding organ selection
    The Committee concludes that BB and MM cannot be used to identify substances that
    are mutagenic in germ cells. This is because they cannot detect substances like MMS,
    which are only genotoxic in post-meiotic sperm. According to the Committee, however,
    all of the known germ cell mutagens have also been found to be mutagenic in other cell
    types. Thus, partly on the basis of theoretical considerations, they view all substances
    which possess genotoxic properties as potential germ cell mutagens.
          In theory, BB and MM can be used (without such restrictions) to determine whether
    substances are mutagenic in organs other than those of the reproductive system. This
    theory is confirmed by results from the limited number of studies that have investigated
    this assumption.
4.2 Viability for risk assessment
    Interpretation of future assay results
    The assay results obtained to date clearly show that positive scores can identify geno-
    toxic substances with a high degree of reliability (albeit less than 100 percent). The
    Conclusions and recommendations                                                               103
</pre>

====================================================================== Einde pagina 103 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 104 ======================================================================

<pre>    Committee therefore takes the view that a positive score is sufficient reason to regard
    the substance in question as genotoxic. Another factor in the equation is the unique char-
    acter of the assay systems, which is that they detect genotoxic substances which can
    induce gene mutations in vivo.
         Negative results appear to be associated with a greater degree of uncertainty. These
    are exactly the results that people want to be able to present as proof that a substance is
    safe. The Committee feels that the assays still yield too many false negative results for a
    negative score to be accepted as proof of the absence of genotoxic properties.
    Viability for routine use
    On the basis of its verdict on reliability, the Committee takes the view that assay systems
    using reporter genes are now able to provide valuable information. Since BB and MM
    enable all organs (with a limitation only in the case of the reproductive organs) to be
    assayed for the presence of mutations, the assay’s design can be geared to the substance
    under investigation. This reduces the risk of false negative results.
         However, the Committee sees no reason, as yet, to introduce the assay into routine
    use. After all, that would involve working in accordance with a protocol setting out
    broad outlines of the way in which the assay must be performed. The Committee feels
    that it is not yet possible to draft a protocol of this kind. We must wait and see whether
    or not it will ultimately be possible to perform the assays with sufficient reliability and
    in accordance with a standard protocol of this kind or, at the very least, with smaller pro-
    cedural variations than has previously been the case. In order to bring the realisation of
    that objective closer, in the following subsection the Committee puts forward various
    suggestions regarding assay design.
4.3 Recommendations regarding further validation and standardisation
    Formulating sub-protocols in the face of little or no toxicological information
    If there is little or no toxicological information upon which to base a decision concern-
    ing the best design for the assay, then partial agreement in the way that the assay is per-
    formed is a useful step. The Committee takes the view that sub-protocols would be
    appropriate in this situation.
         As with previously standardised assay systems, the mode of administration to exper-
    imental animals must be geared to the physical and chemical properties of the substance
    to be investigated. It is not strictly necessary that the path used to administer the sub-
    stance to experimental animals be the same as the one that might be involved were
    humans to come into contact with the substance in question. After all, the aim is to intro-
104 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 104 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 105 ======================================================================

<pre>duce the substance into the circulatory system, so that every organ is effectively
exposed. Accordingly, water-soluble substances can either be injected intravenously or
administered orally (via the mouth), lipid-soluble compounds must be administered
orally, while gases and volatile liquids must be inhaled.
     Since it is impracticable to assay all organs for mutations, then an assay with limited
scope is an appropriate option. The Committee feels that the analysis of three organs
would be a sensible compromise between what is feasible and the opportunity to detect
genotoxicity. Selection criteria are the degree of exposure and capacity for cell division.
The Committee proposes that, at the very least, the liver and the bone marrow should be
analysed. The identity of the third candidate organ for testing is dependent on the way in
which the substance to be investigated is administered.
     The liver is suitable as it is an organ which is rich in blood vessels. It is this rich
blood supply which promotes contact with the substance that has been administered and,
accordingly, possible damage to the DNA. In addition, the liver converts many sub-
stances to metabolites. This is vital for the purposes of testing, since some non-geno-
toxic substances can be converted to genotoxic metabolites in the liver. In cases such as
this, the organ that is most exposed to these metabolites is the liver. One disadvantage of
the liver is that it normally has a low rate of cell division. With regard to oral exposure
there is yet another reason why the liver is suitable for investigation. Substances which
enter the body by absorption in the gastrointestinal tract are first transported to the liver
by the circulatory system. They must first pass through this organ before they can be dis-
tributed throughout the body. This tends to increase the liver’s exposure still further.
     The second tissue considered by the Committee to be relevant is bone marrow. Mar-
row contains rapidly dividing cells, and is therefore highly sensitive to exposure. The
liver and the bone marrow are admittedly used as target organs in other in vivo assays,
but the Committee does not see this as a problem. Firstly, the assay has a different end
point (gene mutations). Furthermore, it may be found to be more sensitive. The latter
point may seem to contradict previous explanations for the false negative assay results.
In that instance, however, the assay was being compared to classical genotoxicity assays
as a whole, whereas here it is being compared to a single assay.
     In the case of oral administration and injection, the intestine is the third organ that is
appropriate for analysis, given the rapid rate of cell division in the intestinal epithelium.
In the case of oral administration, this is supplemented by the especially effective expo-
sure of the gastrointestinal tract in such cases.
     In the case of inhalation tests, not only the liver and bone marrow but also the lungs
must be targeted for analysis.
     Exposure via the skin (dermal) is not dealt with here, since the administration routes
described above are more effective for the exposure of internal organs.
Conclusions and recommendations                                                                 105
</pre>

====================================================================== Einde pagina 105 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 106 ======================================================================

<pre>    Exploiting opportunities for a tailor-made approach
    If suitable data is available, the assay’s design can be better geared to the substance
    under investigation. Accordingly, in such cases, there is good reason to deviate from the
    partially established protocol outlined above. Data on the distribution of the substance
    and its metabolites throughout the body may, for instance, reveal that it would be better
    to target organs other than those mentioned above. The mode of administration can also
    be changed. In the event of dermal exposure (including suspected dermal exposure) or
    dermal effects, the skin can be exposed to the substance in question and investigated for
    genotoxicity.
         In addition to a free choice of target organs, the assay systems offer several other
    opportunities for a tailor-made approach. Unusually, they provide the opportunity of
    choosing between rats and mice. This is important, for instance, if these two species dif-
    fer markedly in terms of their susceptibility to the substance to be tested, as in the case
    of aflatoxin. The most susceptible species could then be selected. An approach of this
    kind is in keeping with the Health Council advisory report entitled ‘Toxicology testing:
    a more efficient approach’, which calls for an assay that is more in keeping with a sub-
    stance’s use and the associated exposure profile 28.
         The tailor-made approach can even go a step further. Just like normal, non-geneti-
    cally modified animals, BB and MM carry the HPRT gene in each of their cells. This
    enables the individual strengths of endogenous and transgenic reporter gene systems to
    be combined in a single assay.
    Efforts to achieve standardisation
    Aside from the suggested combinations of exposure routes and organs to be investigated
    for gene mutations, various other aspects of the assay lend themselves to a degree of
    standardisation. Since group size and assay design have a much greater effect on the
    result than does the final tissue analysis, it is recommended that efforts be focused on
    these areas 25. The assay design could be standardised in terms of the duration of the
    assay, the exposure schedule, and the statistical analysis. The rate of cell division varies
    from tissue to tissue, and this in turn has implications for the best time at which to carry
    out an analysis 29. In addition, substances also differ in terms of their kinetics. Various
    publications contain suggestions concerning standardisation 11,13,29,30. The Committee
    recommends that protocols be drawn up within the framework of the OECD.
106 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 106 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 107 ======================================================================

<pre>    Harmonised validation
    For the further validation of the assay, the Committee recommends the OECD’s general
    principles for the scientific validation of assay methods, a draft version of which is now
    available 31.
4.4 Recommendations for inclusion in the current testing strategy
    The in vivo assay using a transgenic reporter gene can easily be included in the genotox-
    icity testing currently required by the EU. The EU requires a dossier containing standard
    toxicological data supplied by the manufacturer or the party which uses the substance
    for commercial purposes or which is placing it on the market. In the genotoxicity sec-
    tion, the results are requested of in vitro and in vivo assays which have been carried out
    step by step. The results obtained at each step would determine the characteristics of the
    following step. Exceptions aside, in vitro assays must be carried out first, followed by in
    vivo assays if necessary. It is the production volume and the use to which the substance
    in question is to be put which determine exactly which genotoxicity assays are permitted
    or required in each of the various steps. There are separate regulations for the various
    substance categories, whether intended for end users (for instance, medicinal products
    and crop protection agents) or not (for instance, the so-called existing substances, which
    are recorded as a special list).
         Despite the differences in terms of testing strategy, the Committee believes that the
    possibility of using the new testing systems across all these policy areas is worthy of
    consideration. The assay is already permitted in a few of these areas – including the
    above-mentioned ‘Existing Substances’ – provided that there is a well-supported assay
    design. The Committee recommends that the assay be approved for use in the remaining
    areas, subject to the same conditions.
         The assay systems really come into their own when standardised genotoxicity
    assays produce contradictory findings with regard to the substance in question. Such sit-
    uations occur, for instance, when an in vitro assay for gene mutations yields a positive
    result while the in vivo assays for UDS and chromosomal abnormalities prove to be neg-
    ative. Thanks to the new assay systems, the substance can be assayed for its capacity to
    induce gene mutations in vivo, something that was previously impossible.
         The in vivo assay for gene mutations is therefore a valuable element for the current
    testing strategy. However, it is laborious and time-consuming in comparison to the
    established assays. Furthermore, there is no standardisation, which is a major precondi-
    tion for validation. The Committee therefore feels that, for the time being, it is suitable
    as an ad hoc supplement to the current assays, such as those for UDS and chromosomal
    abnormalities referred to above.
    Conclusions and recommendations                                                             107
</pre>

====================================================================== Einde pagina 107 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 108 ======================================================================

<pre>108 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 108 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 109 ======================================================================

<pre>  Literature
1 Europese Raad. Richtlijn 67/548/EEG betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke
  bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen. Publicatieblad van
  de Europese Gemeenschappen 1967; 196: 1
2 Gezondheidsraad. Betekenis van mutageniteitstests. Den Haag: Gezondheidsraad; 1995: Publicatie nr 1995/
  20.
3 Gezondheidsraad. Beoordeling carcinogeniteit van stoffen. Den Haag: Gezondheidsraad; 1996: Publicatie
  nr 1996/26.
4 International Programme on Chemical Safety. Descriptons of selected key generic terms used in chemical
  hazard/risk assessment. Genève: WHO; 2004. Internet: www.who.int/ipcs .
5 Verenigde Naties. The Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS).
  New York en Genève: Verenigde Naties; 2003. Internet: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/
  ghs.html .
6 European Commission. Technical Guidance Document on Risk Assessment in support of Commission
  Directive 93/67/EEC on Risk Assessment for new notified substances, Commission Regulation (EC) No
  1488/94 on Risk Assessment for existing substances, Directive 98/8/EC of the European Parliament and of
  the Council concerning the placing of biocidal products on the market. Part I. Ispra: European Commission
  Joint Research Centre: European Chemicals Bureau; 2003. Internet: http://ecb.jrc.it .
7 Europese Raad. Richtlijn van de Raad van 27 juli 1976 betreffende de onderlinge aanpassing van de
  wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen der Lidstaten inzake de beperking van het op de markt brengen
  en van het gebruik van bepaalde gevaarlijke stoffen en preparaten. Publicatieblad van de Europese Unie
  1976; L 262: 201
  Literature                                                                                                 109
</pre>

====================================================================== Einde pagina 109 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 110 ======================================================================

<pre>8   Willems MI, van Benthem J. Mutagenicity of chemicals in genetically modified animals. Bilthoven: RIVM;
    2000: RIVM report 650210002; TNO report V99.1097.
9   Malling HV, Delongchamp RR. Direct separation of in vivo and in vitro am3 revertants in transgenic mice
    carrying the phiX174 am3, cs70 vector. Environ Mol Mutagen 2001; 37(4): 345-355
10  Weaver RP, Malling HV. The in vivo but not the in vitro am3 revertant frequencies increase linearly with
    increased ethylnitrosourea doses in spleen of mice transgenic for phiX174 am3, cs70 using the single burst
    assay. Mutat Res 2003; 534(1-2): 1-13
11  Gorelick NJ. Overview of mutation assays in transgenic mice for routine testing. Environmental and
    Molecular Mutagenesis 1995; 25: 218-30
12  Schmezer P, Eckert C. Induction of mutations in transgenic animal models: BigBlue™ and Muta™Mouse.
    In: McGregor DB, Rice JM, Venitt S, editors. The use of short- and medium-term tests for carcinogens and
    data on genetic effects in carcinogenic hazard evaluation. Lyon: International Agency for Research on
    Cancer; 1999: 367-94.
13  Thybaud V, Dean S, Nohmi T, de Boer J, Douglas GR, Glickman BW et al. In vivo transgenic mutation
    assays. Mutat Res 2003; 540(2): 141-151
14  Ehling UH, Doherty DG, Malling HV. Differential spermatogenic response of mice to the induction of
    dominant-lethal mutations by n-propyl methanesulfonate and isopropyl methanesulfonate. Mutat Res 1972;
    15(2): 175-184
15  Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus mutations in male mice by ethyl
    methanesulfonate (EMS). Mutat Res 1989; 227(2): 91-95
16  Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus and dominant lethal mutations in male mice in
    the low dose range by methyl methanesulfonate (MMS). Mutat Res 1990; 230(1): 61-70
17  Ehling UH, Neuhauser-Klaus A. Induction of specific-locus and dominant lethal mutations in male mice by
    1-methyl-1-nitrosourea (MNU). Mutat Res 1991; 250(1-2): 447-456
18  Favor J, Sund M, Neuhauser-Klaus A, Ehling UH. A dose-response analysis of ethylnitrosourea-induced
    recessive specific-locus mutations in treated spermatogonia of the mouse. Mutat Res 1990; 231(1): 47-54
19  Favor J, Neuhauser-Klaus A, Ehling UH. The frequency of dominant cataract and recessive specific-locus
    mutations and mutation mosaics in F1 mice derived from post-spermatogonial treatment with
    ethylnitrosourea. Mutat Res 1990; 229(2): 105-114
20  Generoso WM, Cain KT, Krishna M, Huff SW. Genetic lesions induced by chemicals in spermatozoa and
    spermatids of mice are repaired in the egg. Proc Natl Acad Sci U S A 1979; 76(1): 435-437
21  Katoh M, Iwahara S. Relationship between chromosome aberrations at the first cleavage metaphases and
    postimplantation loss in dominant lethal mutations induced by isopropyl methanesulfonate. Jpn J Genet
    1983; 58: 345-351
22  Tinwell H, Liegibel U, Krebs O, Schmezer P, Favor J, Ashby J. Comparison of lacI and lacZ transgenic
    mouse mutation assays: an EU-sponsored interlaboratory study. Mutat Res 1995; 335(2): 185-190
23  Beranek DT, Weis CC, Swenson DH. A comprehensive quantitative analysis of methylated and ethylated
    DNA using high pressure liquid chromatography. Carcinogenesis 1980; 1(7): 595-606
110 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 110 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 111 ======================================================================

<pre>24 van Zeeland AA. Molecular dosimetry of alkylating agents: quantitative comparison of genetic effects on
   the basis of DNA adduct formation. Mutagenesis 1988; 3(3): 179-191
25 Ashby J, Gorelick NJ, Shelby MD. Mutation assays in male germ cells from transgenic mice: overview of
   study and conclusions. Mutation Research 1997; 388 (2-3): 111-22
26 Katoh M, Inomata T, Horiya N, Suzuki F, Shida T, Ishioka K et al. Studies on mutations in male germ cells
   of transgenic mice following exposure to isopropyl methanesulfonate, ethylnitrosourea or X-ray. Mutat Res
   1994; 341(1): 17-28
27 Shelby MD, Tindall KR. Mammalian germ cell mutagenicity of ENU, IPMS and MMS, chemicals selected
   for a transgenic mouse collaborative study. Mutat Res 1997; 388(2-3): 99-109
28 Gezondheidsraad. Onderzoek gezondheidsrisico's stoffen: een gerichtere benadering. Den Haag:
   Gezondheidsraad; 2001: Publicatie nr 2001/24.
29 Heddle JA, Martus HJ, Douglas GR. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays.
   Environmental and Molecular Mutagenesis 2003; 41: 1-6
30 Heddle JA, Dean S, Nohmi T, Boerrigter M, Casciano D, Douglas GR et al. In vivo transgenic mutation
   assays. Environmental and Molecular Mutagenesis 2000; 35: 253-59
31 OECD. Draft guidance document on the validation and international acceptance of new or updated test
   methods for hazard assessment. Parijs: Organisation for Economic Co-operation and Development,
   Environment Directorate; 2003: OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and
   Assessment No. 34.
32 Brooks TM, Szegedi M, Rosher P, Dean SW. The detection of gene mutation in transgenic mice (Muta
   Mouse) following a single oral dose of 2-acetylaminofluorene. Mutagenesis 1995; 10(2): 149-150
33 Gunz D, Shephard SE, Lutz WK. Can nongenotoxic carcinogens be detected with the lacI transgenic mouse
   mutation assay? Environ Mol Mutagen 1993; 21(3): 209-211
34 Shephard SE, Sengstag C, Lutz WK, Schlatter C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue)
   following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res 1993; 302(2): 91-96
35 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Relative activities of methyl methanesulphonate (MMS) as a genotoxin,
   clastogen and gene mutagen to the liver and bone marrow of MutaMouse mice. Environ Mol Mutagen 1998;
   32(2): 163-172
36 Health Council of the Netherlands. Acrylamide; Evaluation of the carcinogenicity and genotoxicity. The
   Hague: Health Council of the Netherlands; 2002: publication no 2002/02OSH.
37 Hoorn AJ, Custer LL, Myhr BC, Brusick D, Gossen J, Vijg J. Detection of chemical mutagens using Muta
   Mouse: a transgenic mouse model. Mutagenesis 1993; 8(1): 7-10
38 Krebs O, Favor J. Somatic and germ cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
   acrylamide or ethylnitrosourea. Mutat Res 1997; 388(2-3): 239-248
39 Myhr BC. Validation studies with Muta Mouse: a transgenic mouse model for detecting mutations in vivo.
   Environ Mol Mutagen 1991; 18(4): 308-315
40 Monroe TJ, Mitchell MA. In vivo mutagenesis induced by CC-1065 and adozelesin DNA alkylation in a
   transgenic mouse model. Cancer Res 1993; 53(23): 5690-5696
   Literature                                                                                                111
</pre>

====================================================================== Einde pagina 111 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 112 ======================================================================

<pre>41  Dutch Expert Committee on Occupational Standards. Scientific documentation on the Dutch list of
    occupational carcinogens I. Den Haag: SDU; 1995: report nr RA 1/95.
42  Autrup H, Jorgensen EC, Jensen O. Aflatoxin B1 induced lacI mutation in liver and kidney of transgenic
    mice C57BL/6N: effect of phorone. Mutagenesis 1996; 11(1): 69-73
43  Davies R, Oreffo VI, Martin EA, Festing MF, White IN, Smith LL et al. Tamoxifen causes gene mutations
    in the livers of lambda/lacI transgenic rats. Cancer Res 1997; 57(7): 1288-1293
44  Davies R, Gant TW, Smith LL, Styles JA. Tamoxifen induces G:C-->T:A mutations in the cII gene in the
    liver of lambda/lacI transgenic rats but not at 5'-CpG-3' dinucleotide sequences as found in the lacI
    transgene. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1351-1356
45  Dycaico MJ, Stuart GR, Tobal GM, de Boer JG, Glickman BW, Provost GS. Species-specific differences in
    hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following
    exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis 1996; 17(11): 2347-2356
46  Ohsawa K, Hirano N, Sugiura M, Nakagawa S, Kimura M. Genotoxicity of o-aminoazotoluene (AAT)
    determined by the Ames test, the in vitro chromosomal aberration test, and the transgenic mouse gene
    mutation assay. Mutat Res 2000; 471(1-2): 113-126
47  Fletcher K, Tinwell H, Ashby J. Mutagenicity of the human bladder carcinogen 4-aminobiphenyl to the
    bladder of MutaMouse transgenic mice. Mutat Res 1998; 400(1-2): 245-250
48  Turner SD, Tinwell H, Piegorsch W, Schmezer P, Ashby J. The male rat carcinogens limonene and sodium
    saccharin are not mutagenic to male Big Blue rats. Mutagenesis 2001; 16(4): 329-332
49  Ochiai M, Ishida K, Ushijima T, Suzuki T, Sofuni T, Sugimura T et al. DNA adduct level induced by 2-
    amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]-quinoline in Big Blue mice does not correlate with mutagenicity.
    Mutagenesis 1998; 13(4): 381-384
50  Suzuki T, Hayashi M, Ochiai M, Wakabayashi K, Ushijima T, Sugimura T et al. Organ variation in the
    mutagenicity of MeIQ in Big Blue lacI transgenic mice. Mutat Res 1996; 369(1-2): 45-49
51  Davis CD, Dacquel EJ, Schut HA, Thorgeirsson SS, Snyderwine EG. In vivo mutagenicity and DNA adduct
    levels of heterocyclic amines in Muta mice and c-myc/lacZ double transgenic mice. Mutat Res 1996;
    356(2): 287-296
52  Itoh T, Suzuki T, Nishikawa A, Furukawa F, Takahashi M, Xue W et al. In vivo genotoxicity of 2-amino-
    3,8-dimethylimidazo[4, 5-f]quinoxaline in lacI transgenic (Big Blue) mice. Mutat Res 2000; 468(1): 19-25
53  Thorgeirsson SS, Ryu DY, Weidner V, Snyderwine EG. Carcinogenicity and mutagenicity of heterocyclic
    amines in transgenic mouse models. Cancer Lett 1999; 143(2): 245-247
54  Bol SA, Horlbeck J, Markovic J, de Boer JG, Turesky RJ, Constable A. Mutational analysis of the liver,
    colon and kidney of Big Blue rats treated with 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline. Carcinogenesis
    2000; 21(1): 1-6
55  Lynch AM, Gooderham NJ, Boobis AR. Organ distinctive mutagenicity in MutaMouse after short-term
    exposure to PhIP. Mutagenesis 1996; 11(5): 505-509
56  Okonogi H, Stuart GR, Okochi E, Ushijima T, Sugimura T, Glickman BW et al. Effects of gender and
    species on spectra of mutation induced by 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in the lacI
    transgene. Mutat Res 1997; 395(2-3): 93-99
112 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 112 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 113 ======================================================================

<pre>57 Stuart GR, Holcroft J, de Boer JG, Glickman BW. Prostate mutations in rats induced by the suspected
   human carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine. Cancer Res 2000; 60(2): 266-268
58 Stuart GR, de Boer JG, Haesevoets R, Holcroft J, Kangas J, Sojonky K et al. Mutations induced by 2-
   amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4,5-b]pyridine (PhIP) in cecum and proximal and distal colon of lacI
   transgenic rats. Mutagenesis 2001; 16(5): 431-437
59 Yang H, Stuart GR, Glickman BW, de Boer JG. Modulation of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-
   b]pyridine-induced mutation in the cecum and colon of big blue rats by conjugated linoleic acid and 1,2-
   dithiole-3-thione. Nutr Cancer 2001; 39(2): 259-266
60 Yang H, Holcroft J, Glickman BW, de Boer JG. Conjugated linoleic acid inhibits mutagenesis by 2-amino-
   1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine in the prostate of Big Blue rats. Mutagenesis 2003; 18(2): 195-
   200
61 Zhang S, Lloyd R, Bowden G, Glickman BW, de Boer JG. Msh2 DNA mismatch repair gene deficiency and
   the food-borne mutagen 2-amino-1-methy1-6-phenolimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) synergistically affect
   mutagenesis in mouse colon. Oncogene 2001; 20(42): 6066-6072
62 Gezondheidsraad: Commissie Risico-evaluatie van stoffen. Arseen. Toetsing van een basisdocument. Den
   Haag: Gezondheidsraad; 1993: publicatie nr 1993/02.
63 Noda Y, Suzuki T, Kohara A, Hasegawa A, Yotsuyanagi T, Hayashi M et al. In vivo genotoxicity
   evaluation of dimethylarsinic acid in MutaMouse. Mutat Res 2002; 513(1-2): 205-212
64 Gezondheidsraad, Commissie Beoordeling carcinogeniteit van stoffen. Benzeen. Rijswijk:
   Gezondheidsraad; 1997: publicatie no 1997/29.
65 Provost GS, Mirsalis JC, Rogers BJ, Short JM. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-
   phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation
   analysis. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 342-347
66 Gezondheidsraad. Polycyclische aromatische koolwaterstoffen; toetsing van een basisdocument. Den Haag:
   Gezondheidsraad; 1990: publicatie nr 1990/23.
67 Dean SW, Coates A, Brooks TM, Burlinson B. Benzo[a]pyrene site of contact mutagenicity in skin of Muta
   Mouse. Mutagenesis 1998; 13(5): 515-518
68 Hakura A, Tsutsui Y, Sonoda J, Kai J, Imade T, Shimada M et al. Comparison between in vivo mutagenicity
   and carcinogenicity in multiple organs by benzo[a]pyrene in the lacZ transgenic mouse (Muta Mouse).
   Mutat Res 1998; 398(1-2): 123-130
69 Kohler SW, Provost GS, Fieck A, Kretz PL, Bullock WO, Sorge JA et al. Spectra of spontaneous and
   mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88(18):
   7958-7962
70 Kohler SW, Provost GS, Fieck A, Kretz PL, Bullock WO, Putman DL et al. Analysis of spontaneous and
   induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ Mol Mutagen 1991;
   18(4): 316-321
71 Loli P, Topinka J, Georgiadis P, Dusinska M, Hurbankova M, Kovacikova Z et al. Benzo[a]pyrene-
   enhanced mutagenesis by asbestos in the lung of lambda-lacI transgenic rats. Mutat Res 2004; 553(1-2): 79-
   90
   Literature                                                                                                 113
</pre>

====================================================================== Einde pagina 113 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 114 ======================================================================

<pre>72  Skopek TR, Kort KL, Marino DR, Mittal LV, Umbenhauer DR, Laws GM et al. Mutagenic response of the
    endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol
    Mutagen 1996; 28(4): 376-384
73  Recio L, Osterman-Golkar S, Csanady GA, Turner MJ, Myhr B, Moss O et al. Determination of
    mutagenicity in tissues of transgenic mice following exposure to 1,3-butadiene and N-ethyl-N-nitrosourea.
    Toxicol Appl Pharmacol 1992; 117(1): 58-64
74  Recio L, Bond JA, Pluta LJ, Sisk SC. Use of transgenic mice for assessing the mutagenicity of 1,3-
    butadiene in vivo. IARC Sci Publ 1993;(127): 235-243
75  Recio L, Meyer KG, Pluta LJ, Moss OR, Saranko CJ. Assessment of 1,3-butadiene mutagenicity in the bone
    marrow of B6C3F1 lacI transgenic mice (Big Blue): a review of mutational spectrum and lacI mutant
    frequency after a 5-day 625 ppm 1,3-butadiene exposure. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 424-429
76  Sisk SC, Pluta LJ, Bond JA, Recio L. Molecular analysis of lacI mutants from bone marrow of B6C3F1
    transgenic mice following inhalation exposure to 1,3-butadiene. Carcinogenesis 1994; 15(3): 471-477
77  Staedtler F, Crespo-Perez J, Sagelsdorff P, Steiner S, Suter W. 4-chloro-o-phenylenediamine induces a
    dose-related increase in G:C > T:A transversions and one major DNA adduct in the liver of Big Blue mice
    after 26 weeks in feed treatment. Mutat Res 1999; 430(1): 121-130
78  Suter W, Ahiabor R, Blanco B, Locher F, Mantovani F, Robinson M et al. Evaluation of the in vivo
    genotoxic potential of three carcinogenic aromatic amines using the Big Blue transgenic mouse mutation
    assay. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 354-362
79  Suter W, Staedtler F, Poetter-Locher F, Swingler T, Wilson L. 4-Chloro-o-phenylenediamine: a 26-week
    oral (in feed) mutagenicity study in Big Blue mice. Mutat Res 1998; 414(1-3): 149-156
80  Gezondheidsraad. Chroom; Toetsing van een basisdocument. Rijswijk: Gezondheidsraad; 1991: publicatie
    nr 1991/03.
81  Itoh S, Shimada H. Clastogenicity and mutagenicity of hexavalent chromium in lacZ transgenic mice.
    Toxicol Lett 1997; 91(3): 229-233
82  Itoh S, Shimada H. Bone marrow and liver mutagenesis in lacZ transgenic mice treated with hexavalent
    chromium. Mutat Res 1998; 412(1): 63-67
83  Cheng L, Sonntag DM, de Boer J, Dixon K. Chromium(VI)-induced mutagenesis in the lungs of big blue
    transgenic mice. J Environ Pathol Toxicol Oncol 2000; 19(3): 239-249
84  Dutch Expert Committee on Occupational Standards. Scientific documentation on the Dutch list of
    occupational carcinogens II. Den Haag: Sdu; 1995: report nr RA 2/95.
85  Louro H, Silva MJ, Boavida MG. Mutagenic activity of cisplatin in the lacZ plasmid-based transgenic
    mouse model. Environ Mol Mutagen 2002; 40(4): 283-291
86  Gorelick NJ, Andrews JL, deBoer JG, Young R, Gibson DP, Walker VE. Tissue-specific mutant
    frequencies and mutational spectra in cyclophosphamide-treated lacI transgenic mice. Environ Mol
    Mutagen 1999; 34(2-3): 154-166
87  Hoyes KP, Wadeson PJ, Sharma HL, Hendry JH, Morris ID. Mutation studies in lacI transgenic mice after
    exposure to radiation or cyclophosphamide. Mutagenesis 1998; 13(6): 607-612
114 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 114 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 115 ======================================================================

<pre>88  Walker VE, Andrews JL, Upton PB, Skopek TR, deBoer JG, Walker DM et al. Detection of
    cyclophosphamide-induced mutations at the Hprt but not the lacI locus in splenic lymphocytes of exposed
    mice. Environ Mol Mutagen 1999; 34(2-3): 167-181
89  Krebs O, Schafer B, Wolff T, Oesterle D, Deml E, Sund M et al. The DNA damaging drug cyproterone
    acetate causes gene mutations and induces glutathione-S-transferase P in the liver of female Big Blue
    transgenic F344 rats. Carcinogenesis 1998; 19(2): 241-245
90  Cunningham ML, Hayward JJ, Shane BS, Tindall KR. Distinction of mutagenic carcinogens from a
    mutagenic noncarcinogen in the big blue transgenic mouse. Environ Health Perspect 1996; 104 Suppl 3:
    683-686
91  Hayward JJ, Shane BS, Tindall KR, Cunningham ML. Differential in vivo mutagenicity of the carcinogen/
    non-carcinogen pair 2,4- and 2,6-diaminotoluene. Carcinogenesis 1995; 16(10): 2429-2433
92  Mientjes EJ, Luiten-Schuite A, van der WE, Borsboom Y, Bergmans A, Berends F et al. DNA adducts,
    mutant frequencies, and mutation spectra in various organs of lambda lacZ mice exposed to ethylating
    agents. Environ Mol Mutagen 1998; 31(1): 18-31
93  Okada N, Honda A, Kawabata M, Yajima N. Sodium phenobarbital-enhanced mutation frequency in the
    liver DNA of lacZ transgenic mice treated with diethylnitrosamine. Mutagenesis 1997; 12(3): 179-184
94  Suzuki T, Hayashi M, Sofuni T. Initial experiences and future directions for transgenic mouse mutation
    assays. Mutat Res 1994; 307(2): 489-494
95  Suzuki T, Itoh T, Hayashi M, Nishikawa Y, Ikezaki S, Furukawa F et al. Organ variation in the
    mutagenicity of dimethylnitrosamine in Big Blue mice. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 348-353
96  Health Council of the Netherlands: Dutch Expert Committee on Occupational Standards (DECOS). N-
    Nitrosodimethylamine. The Hague: Health Council of the Netherlands; 1999: publication no. 1999/12OSH.
97  Ashby J, Short JM, Jones NJ, Lefevre PA, Provost GS, Rogers BJ et al. Mutagenicity of o-anisidine to the
    bladder of lacI- transgenic B6C3F1 mice: absence of 14C or 32P bladder DNA adduction. Carcinogenesis
    1994; 15(10): 2291-2296
98  Mirsalis JC, Hamer JD, O'Loughlin KG, 'Winegar RA, Short JM. Effects of nongenotoxic carcinogens on
    hepatic mutations in lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1993; 21(suppl 22): 48
99  Mirsalis JC, Provost GS, Matthews CD, Hamner RT, Schindler JE, O'Loughlin KG et al. Induction of
    hepatic mutations in lacI transgenic mice. Mutagenesis 1993; 8(3): 265-271
100 Schmezer P, Eckert C, Liegibel UM, Klein RG, Bartsch H. Use of Transgenic Mutational Test Systems in
    Risk Assessment of Carcinogens. Arch Toxicol 1998; 20: 321-30
101 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Response of the Muta mouse lacZ/galE- transgenic mutation assay to
    DMN: comparisons with the corresponding Big Blue (lacI) responses. Mutat Res 1994; 307(1): 169-173
102 Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Mutation studies with dimethyl nitrosamine in young and old lac I
    transgenic mice. Mutat Res 1994; 307(2): 501-508
103 Shane BS, deBoer JG, Glickman BW, Cunningham ML. Oxazepam is mutagenic in vivo in Big Blue
    transgenic mice. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1315-1321
    Literature                                                                                               115
</pre>

====================================================================== Einde pagina 115 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 116 ======================================================================

<pre>104 Shephard SE, Lutz WK, Schlatter C. The lacI transgenic mouse mutagenicity assay: quantitative evaluation
    in comparison to tests for carcinogenicity and cytogenetic damage in vivo. Mutat Res 1994; 306(2): 119-
    128
105 Shephard SE, Gunz D, Schlatter C. Genotoxicity of agaritine in the lacI transgenic mouse mutation assay:
    evaluation of the health risk of mushroom consumption. Food Chem Toxicol 1995; 33(4): 257-264
106 Suzuki T, Miyata Y, Saeki K, Kawazoe Y, Hayashi M, Sofuni T. In vivo mutagenesis by the
    hepatocarcinogen quinoline in the lacZ transgenic mouse: evidence for its in vivo genotoxicity. Mutat Res
    1998; 412(2): 161-166
107 Lefevre PA, Tinwell H, Ashby J. Mutagenicity of the potent rat hepatocarcinogen 6BT to the liver of
    transgenic (lacI) rats: consideration of a reduced mutation assay protocol. Mutagenesis 1997; 12(1): 45-47
108 Ashby J, Brusick D, Myhr BC, Jones NJ, Parry JM, Nesnow S et al. Correlation of carcinogenic potency
    with mouse-skin 32P-postlabeling and Muta-RMouse lac Z- mutation data for DMBA and its K-region
    sulphur isostere: comparison with activities observed in standard genotoxicity assays. Mutat Res 1993;
    292(1): 25-40
109 Brooks TM, Dean SW. Detection of gene mutation in skin, stomach and liver of MutaMouse following oral
    or topical treatment with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or 1-chloromethylpyrene: some
    preliminary observations. Mutagenesis 1996; 11(5): 529-532
110 Hachiya N, Yajima N, Hatakeyama S, Yuno K, Okada N, Umeda Y et al. Induction of lacZ mutation by
    7,12-dimethylbenz[a]anthracene in various tissues of transgenic mice. Mutat Res 1999; 444(2): 283-295
111 Gorelick NJ, Andrews JL, Gu M, Glickman BW. Mutational spectra in the lacl gene in skin from 7,12-
    dimethylbenz[a]anthracene-treated and untreated transgenic mice. Mol Carcinog 1995; 14(1): 53-62
112 Tombolan F, Renault D, Brault D, Guffroy M, Perin-Roussel O, Perin F et al. Kinetics of induction of DNA
    adducts, cell proliferation and gene mutations in the liver of MutaMice treated with 5,9-
    dimethyldibenzo[c,g]carbazole. Carcinogenesis 1999; 20(1): 125-132
113 Tombolan F, Renault D, Brault D, Guffroy M, Perin F, Thybaud V. Effect of mitogenic or regenerative cell
    proliferation on lacz mutant frequency in the liver of MutaTMMice treated with 5, 9-
    dimethyldibenzo[c,g]carbazole. Carcinogenesis 1999; 20(7): 1357-1362
114 Gezondheidsraad. Ethyleenoxide en styreen; toetsing van criteriadocumenten. Rijswijk: Gezondheidsraad;
    1986: publicatie nr 1986/17.
115 Sisk SC. Determination of circulating micronuclei and mutant frequency in lung, spleen, and germ cells of
    male B6C3F1 LacI transgenic mice after inhalation exposure to ethylene oxide (EtO). Environ Mol
    Mutagen 1994; 23(suppl 23): 62
116 Sisk SC, Pluta LJ, Meyer KG, Wong BC, Recio L. Assessment of the in vivo mutagenicity of ethylene
    oxide in the tissues of B6C3F1 lacI transgenic mice following inhalation exposure. Mutat Res 1997; 391(3):
    153-164
117 van Delft JH, Bergmans A, Baan RA. Germ-cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
    ethylating and methylating agents: comparison with specific-locus test. Mutat Res 1997; 388(2-3): 165-173
116 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 116 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 117 ======================================================================

<pre>118 van Delft JH, Bergmans A, van Dam FJ, Tates AD, Howard L, Winton DJ et al. Gene-mutation assays in
    lambda lacZ transgenic mice: comparison of lacZ with endogenous genes in splenocytes and small intestinal
    epithelium. Mutat Res 1998; 415(1-2): 85-96
119 Suzuki T, Hayashi M, Wang X, Yamamoto K, Ono T, Myhr BC et al. A comparison of the genotoxicity of
    ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta Mouse). Mutat Res 1997;
    395(1): 75-82
120 The Collaborative Study Group of the Transgenic Mouse Mutation Assay MMSGotEMSoJ. Organ variation
    in the mutagenicity of ethylnitrosourea in MutaMouse: result of the Collaborative Study on the Transgenic
    Mutation Assay by JEMS/MMS. Environ Mol Mutagen 1996; 28: 363-375
121 Brooks TM, Dean SW. The detection of gene mutation in the tubular sperm of Muta Mice following a single
    intraperitoneal treatment with methyl methanesulphonate or ethylnitrosourea. Mutat Res 1997; 388(2-3):
    219-222
122 Cosentino L, Heddle JA. A test for neutrality of mutations of the lacZ transgene. Environ Mol Mutagen
    1996; 28(4): 313-316
123 Cruz-Munoz W, Kalair W, Cosentino L, Heddle JA. ENU induces mutations in the heart of lacZ transgenic
    mice. Mutat Res 2000; 469(1): 23-34
124 da Costa GG, Manjanatha MG, Marques MM, Beland FA. Induction of lacI mutations in Big Blue rats
    treated with tamoxifen and alpha-hydroxytamoxifen. Cancer Lett 2002; 176(1): 37-45
125 van Delft JH, Baan RA. Germ cell mutagenesis in lambda lacZ transgenic mice treated with
    ethylnitrosourea; comparison with specific-locus test. Mutagenesis 1995; 10(3): 209-214
126 Dolle ME, Martus HJ, Gossen JA, Boerrigter ME, Vijg J. Evaluation of a plasmid-based transgenic mouse
    model for detecting in vivo mutations. Mutagenesis 1996; 11(1): 111-118
127 Douglas GR, Jiao J, Gingerich JD, Gossen JA, Soper LM. Temporal and molecular characteristics of
    mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa
    of lacZ transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(16): 7485-7489
128 Douglas GR, Jiao J, Gingerich JD, Soper LM, Gossen JA. Temporal and molecular characteristics of lacZ
    mutations in somatic tissues of transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1996; 28(4): 317-324
129 Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM, Jiao J. Toward an understanding of the use of transgenic mice for
    the detection of gene mutations in germ cells. Mutat Res 1997; 388(2-3): 197-212
130 Gorelick NJ, Andrews JL, Gibson DP, Carr GJ, Aardema MJ. Evaluation of lacI mutation in germ cells and
    micronuclei in peripheral blood after treatment of male lacI transgenic mice with ethylnitrosourea,
    isopropylmethane sulfonate or methylmethane sulfonate. Mutat Res 1997; 388(2-3): 187-195
131 Itoh S, Miura M, Shimada H. Lack of mutagenicity of levofloxacin in lacZ transgenic mice. Mutagenesis
    1998; 13(1): 51-55
132 Liegibel UM, Schmezer P. Detection of the two germ cell mutagens ENU and iPMS using the LacZ/
    transgenic mouse mutation assay. Mutat Res 1997; 388(2-3): 213-218
133 Morrison V, Tinwell H, Ashby J. Consideration of the liver of embryonic lacZ transgenic mice as an
    analogue of the mouse coat colour spot test: preliminary data and technical problems. Mutat Res 1995;
    329(2): 107-112
    Literature                                                                                                117
</pre>

====================================================================== Einde pagina 117 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 118 ======================================================================

<pre>134 Provost GS, Short JM. Characterization of mutations induced by ethylnitrosourea in seminiferous tubule
    germ cells of transgenic B6C3F1 mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91(14): 6564-6568
135 Provost GS, Rogers BJ, Dycaico MJ, Carr G. Evaluation of the transgenic Lambda/LacI mouse model as a
    short-term predictor of heritable risk. Mutat Res 1997; 388(2-3): 129-136
136 Skopek TR, Kort KL, Marino DR. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in
    ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen 1995; 26(1): 9-15
137 Suzuki T, Itoh S, Takemoto N, Yajima N, Miura M, Hayashi M et al. Ethyl nitrosourea and methyl
    methanesulfonate mutagenicity in sperm and testicular germ cells of lacZ transgenic mice (Muta Mouse).
    Mutat Res 1997; 388(2-3): 155-163
138 Tinwell H, Lefevre P, Williams CV, Ashby J. The activity of ENU, iPMS and MMS in male mouse germ
    cells using the Muta Mouse positive selection transgenic mutation assay. Mutat Res 1997; 388(2-3): 179-
    185
139 Walker VE, Gorelick NJ, Andrews JL, Craft TR, deBoer JG, Glickman BW et al. Frequency and spectrum
    of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI
    transgenic mice. Cancer Res 1996; 56(20): 4654-4661
140 Winegar RA, Carr G, Mirsalis JC. Analysis of the mutagenic potential of ENU and MMS in germ cells of
    male C57BL/6 lacI transgenic mice. Mutat Res 1997; 388(2-3): 175-178
141 Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM. Evidence for in vivo non-mutagenicity of the carcinogen hydrazine
    sulfate in target tissues of lacZ transgenic mice. Carcinogenesis 1995; 16(4): 801-804
142 Chen T, Mittelstaedt RA, Aidoo A, Hamilton LP, Beland FA, Casciano DA et al. Comparison of hprt and
    lacI mutant frequency with DNA adduct formation in N-hydroxy-2-acetylaminofluorene-treated Big Blue
    rats. Environ Mol Mutagen 2001; 37(3): 195-202
143 Frijhoff AF, Krul CA, de Vries A, Kelders MC, Weeda G, van Steeg H et al. Influence of nucleotide
    excision repair on N-hydroxy-2-acetylaminofluorene-induced mutagenesis studied in lambda lacZ-
    transgenic mice. Environ Mol Mutagen 1998; 31(1): 41-47
144 Pletsa V, Steenwinkel MJ, van Delft JH, Baan RA, Kyrtopoulos SA. Methyl bromide causes DNA
    methylation in rats and mice but fails to induce somatic mutations in lambda lacZ transgenic mice. Cancer
    Lett 1999; 135(1): 21-27
145 Rihn BH, Bottin MC, Coulais C, Rouget R, Monhoven N, Baranowski W et al. Genotoxicity of 3-
    methylcholanthrene in liver of transgenic big Blue mice. Environ Mol Mutagen 2000; 36(4): 266-273
146 Itoh S, Miura M, Shimada H. Germ cell mutagenesis in lacZ transgenic mice treated with methyl
    methanesulfonate. Mutat Res 1997; 388(2-3): 223-228
147 Brault D, Bouilly C, Renault D, Thybaud V. Tissue-specific induction of mutations by acute oral
    administration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine and beta-propiolactone to the Muta Mouse:
    preliminary data on stomach, liver and bone marrow. Mutat Res 1996; 360(2): 83-87
148 Brault D, Renault D, Tombolan F, Thybaud V. Kinetics of induction of DNA damage and lacZ gene
    mutations in stomach mucosa of mice treated with beta-propiolactone and N-methyl-N'-nitro-N-
    nitrosoguanidine, using single-cell gel electrophoresis and MutaMouse models. Environ Mol Mutagen
    1999; 34(2-3): 182-189
118 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 118 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 119 ======================================================================

<pre>149 Monroe JJ, Kort KL, Miller JE, Marino DR, Skopek TR. A comparative study of in vivo mutation assays:
    analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big
    Blue mice. Mutat Res 1998; 421(1): 121-136
150 Provost GS, Kretz PL, Hamner RT, Matthews CD, Rogers BJ, Lundberg KS et al. Transgenic systems for in
    vivo mutation analysis. Mutat Res 1993; 288(1): 133-149
151 Quillardet P, Michel V, Arrault X, Hofnung M, Touati E. Mutagenic properties of a nitrofuran, 7-methoxy-
    2-nitronaphtho[2, 1-b]furan (R7000), in lacI transgenic mice. Mutat Res 2000; 470(2): 177-188
152 Suzuki T, Hayashi M, Sofuni T, Myhr BC. The concomitant detection of gene mutation and micronucleus
    induction by mitomycin C in vivo using lacZ transgenic mice. Mutat Res 1993; 285(2): 219-224
153 Guttenplan JB, Kosinska W, von Pressentin MM, Rosa J, El Bayoumy K. Effects of 1,4-
    phenylenebis(methylene)selenocyanate (p-XSC) and vitamin E on 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO)-
    induced mutagenesis in lacZ mouse upper aerodigestive tissue. Mutat Res 2002; 518(1): 85-93
154 von Pressentin MM, El Bayoumy K, Guttenplan JB. Mutagenic activity of 4-nitroquinoline-N-oxide in
    upper aerodigestive tissue in lacZ mice (MutaMouse) and the effects of 1, 4-
    phenylenebis(methylene)selenocyanate. Mutat Res 2000; 466(1): 71-78
155 Nakajima M, Kikuchi M, Saeki K, Miyata Y, Terada M, Kishida F et al. Mutagenicity of 4-nitroquinoline 1-
    oxide in the MutaMouse. Mutat Res 1999; 444(2): 321-336
156 Jiao J, Douglas GR, Gingerich JD, Soper LM. Analysis of tissue-specific lacZ mutations induced by N-
    nitrosodibenzylamine in transgenic mice. Carcinogenesis 1997; 18(11): 2239-2245
157 Itoh S, Miura M, Itoh T, Miyauchi Y, Suga M, Takahashi Y et al. N-Nitrosodi-n-propylamine induces organ
    specific mutagenesis with specific expression times in lacZ transgenic mice. Mutat Res 1999; 444(2): 309-
    319
158 Hara T, Hirano K, Hirano N, Tamura H, Sui H, Shibuya T et al. Mutation induction by N-propyl-N-
    nitrosourea in eight MutaMouse organs. Mutat Res 1999; 444(2): 297-307
159 Schmezer P, Eckert C, Liegibel UM. Tissue-specific induction of mutations by streptozotocin in vivo.
    Mutat Res 1994; 307(2): 495-499
160 Chen T, Aidoo A, Manjanatha MG, Mittelstaedt RA, Shelton SD, Lyn-Cook LE et al. Comparison of
    mutant frequencies and types of mutations induced by thiotepa in the endogenous Hprt gene and transgenic
    lacI gene of Big Blue rats. Mutat Res 1998; 403(1-2): 199-214
161 de Boer JG, Holcroft J, Cunningham ML, Glickman BW. Tris(2,3-dibromopropyl)phosphate causes a
    gradient of mutations in the cortex and outer and inner medullas of the kidney of lacI transgenic rats.
    Environ Mol Mutagen 2000; 36(1): 1-4
162 Shane BS, Smith-Dunn DL, deBoer JG, Glickman BW, Cunningham ML. Subchronic administration of
    phenobarbital alters the mutation spectrum of lacI in the livers of Big Blue transgenic mice. Mutat Res
    2000; 448(1): 69-80
163 Lefevre PA, Tinwell H, Galloway SM, Hill R, Mackay JM, Elcombe CR et al. Evaluation of the genetic
    toxicity of the peroxisome proliferator and carcinogen methyl clofenapate, including assays using Muta
    Mouse and Big Blue transgenic mice. Hum Exp Toxicol 1994; 13(11): 764-775
    Literature                                                                                                    119
</pre>

====================================================================== Einde pagina 119 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 120 ======================================================================

<pre>164 DeMarini DM, Shelton ML, Kohan MJ, Hudgens EE, Kleindienst TE, Ball LM et al. Mutagenicity in lung
    of big Blue((R)) mice and induction of tandem-base substitutions in Salmonella by the air pollutant
    peroxyacetyl nitrate (PAN): predicted formation of intrastrand cross-links. Mutat Res 2000; 457(1-2): 41-55
165 Gezondheidsraad. Chloroform en tetrachloormethaan; Toetsing van een criteriadocument. Rijswijk:
    Gezondheidsraad; 1987: publicatie nr 1987/15.
166 Gezondheidsraad: Commissie Risico-evaluatie van stoffen - dioxinen. Dioxinen. Polygechloreerde dibenzo-
    p-dioxinen, dibenzofuranen en dioxine-achtige polychloorbifenylen. Rijswijk: Gezondheidsraad; 1996:
    publicatie nr 1996/10.
167 Thornton AS, Oda Y, Stuart GR, Glickman BW, de Boer JG. Mutagenicity of TCDD in Big Blue transgenic
    rats. Mutat Res 2001; 478(1-2): 45-50
168 Provost GS. Evaluation of mutagenic and non-mutagenic compounds using LacI transgenic rodents.
    Environ-Mol-Mutagen 23 (Suppl 23), 55. 1994.
169 Kohara A, Suzuki T, Honma M, Ohwada T, Hayashi M. Mutagenicity of aristolochic acid in the lambda/
    lacZ transgenic mouse (MutaMouse). Mutat Res 2002; 515(1-2): 63-72
170 Gezondheidsraad. Asbest; toetsing van een ontwerp-basisdocument. Den Haag: Gezondheidsraad; 1988:
    publicatie nr 1988/31.
171 Rihn B, Coulais C, Kauffer E, Bottin MC, Martin P, Yvon F et al. Inhaled crocidolite mutagenicity in lung
    DNA. Environ Health Perspect 2000; 108(4): 341-346
172 Topinka J, Loli P, Georgiadis P, Dusinska M, Hurbankova M, Kovacikova Z et al. Mutagenesis by asbestos
    in the lung of lambda-lacI transgenic rats. Mutat Res 2004; 553(1-2): 67-78
173 Unfried K, Schurkes C, Abel J. Distinct spectrum of mutations induced by crocidolite asbestos: clue for 8-
    hydroxydeoxyguanosine-dependent mutagenesis in vivo. Cancer Res 2002; 62(1): 99-104
174 Ashby J. Results for the big blue transgenic assay using two genotoxins and a peroxisome proliferator.
    Environ Mol Mutagen 1993; 21(suppl 22): 4
175 Leavitt SA, DeAngelo AB, George MH, Ross JA. Assessment of the mutagenicity of dichloroacetic acid in
    lacI transgenic B6C3F1 mouse liver. Carcinogenesis 1997; 18(11): 2101-2106
176 Rompelberg CJ, Steenwinkel MJ, van Asten JG, van Delft JH, Baan RA, Verhagen H. Effect of eugenol on
    the mutagenicity of benzo[a]pyrene and the formation of benzo[a]pyrene-DNA adducts in the lambda-lacZ-
    transgenic mouse. Mutat Res 1996; 369(1-2): 87-96
177 Miyata Y, Saeki K, Kawazoe Y, Hayashi M, Sofuni T, Suzuki T. Antimutagenic structural modification of
    quinoline assessed by an in vivo mutagenesis assay using lacZ-transgenic mice. Mutat Res 1998; 414(1-3):
    165-169
178 Culp SJ, Beland FA, Heflich RH, Benson RW, Blankenship LR, Webb PJ et al. Mutagenicity and
    carcinogenicity in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite green. Mutat Res 2002; 506-
    507: 55-63
179 Arrault X, Michel V, Quillardet P, Hofnung M, Touati E. Comparison of kinetics of induction of DNA
    adducts and gene mutations by a nitrofuran compound, 7-methoxy-2-nitronaphtho[2,1-b]furan (R7000), in
    the caecum and small intestine of Big Blue mice. Mutagenesis 2002; 17(4): 353-359
120 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 120 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 121 ======================================================================

<pre>180 Nishikawa A, Furukawa F, Kasahara K, Ikezaki S, Itoh T, Suzuki T et al. Trans-4-hydroxy-2-nonenal, an
    aldehydic lipid peroxidation product, lacks genotoxicity in lacI transgenic mice. Cancer Lett 2000; 148(1):
    81-86
181 Takahashi S, Ikeda Y, Kimoto N, Okochi E, Cui L, Nagao M et al. Mutation induction by mechanical
    irritation caused by uracil-induced urolithiasis in Big Blue rats. Mutat Res 2000; 447(2): 275-280
    Literature                                                                                                  121
</pre>

====================================================================== Einde pagina 121 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 122 ======================================================================

<pre>122 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 122 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 123 ======================================================================

<pre>A Request for advice
B The Committee
C List of concepts
D Summary of substances and their test results
  Annexes
                                               123
</pre>

====================================================================== Einde pagina 123 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 124 ======================================================================

<pre>124 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 124 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 125 ======================================================================

<pre>Annex A
      Request for advice
      The Minister of Health, Welfare and Sport wrote the following letter to the President of
      the Health Council on 3 April 2002 (reference: GZB/C&O/2268208):
      At the behest of the Ministry of Social Affairs and Employment and the Ministry of Health, Welfare and
      Sport, TNO and RIVM prepared a report entitled ‘Mutagenicity of chemicals in genetically modified ani-
      mals’. The report examines new assay models for investigating the mutagenic characteristics of substances.
            Mutagenicity testing is a vitally important aspect of the authorisation of new substances and of the
      assessment of existing substances with a priority status. Mutagenicity plays a key part in the assessment of
      substances, especially in connection with possible carcinogenicity and the potential to cause genetic defects.
      If the substance is classified as a proven mutagen and/or carcinogen, its use by consumers is prohibited.
            As yet, there are no well validated in vivo gene mutation assays that could be used to adequately deter-
      mine a substance’s mutagenicity. The report gives a list of promising in vivo gene mutation assays, per-
      formed using ‘transgenic’ mice.
            I would be grateful if you would advise me whether (and if so which) new in vivo gene mutation assays
      could be used for the routine assessment of substances and what the possible drawbacks might be.
      Yours sincerely,
      The Minister of Health, Welfare and Sport,
      (signed) E Borst-Eilers
      Request for advice                                                                                             125
</pre>

====================================================================== Einde pagina 125 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 126 ======================================================================

<pre>126 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 126 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 127 ======================================================================

<pre>Annex B
      Committee
      The Committee that prepared the above advisory report consisted of:
      • Dr GMH Swaen, chairman until 1 September 2004
         epidemiologist; University Medical Centre, Maastricht (until 1 September 2004),
         Dow Benelux BV, Terneuzen (from 1 September 2004)
      • Dr PJ Boogaard
         toxicologist; Shell International BV, The Hague
      • HC Dreef - van der Meulen
         toxicological pathologist; NV Organon, Oss
      • Prof. VJ Feron (until 19 February 2004)
         Emeritus Professor of Biological Toxicology; Zeist
      • Prof. H van Loveren (from 14 November 2003)
         Professor of Immunotoxicology, University of Maastricht; also National Institute of
         Public Health and the Environment, Bilthoven
      • Prof. GR Mohn (until 1 January 2004)
         Professor of Cellular Mutation Genetics, Leiden University Medical Center
      • Prof. GJ Mulder
         Professor of Toxicology, Leiden/Amsterdam Center for Drug Research, Leiden
      • Dr MJM Nivard
         molecular biologist and genetic toxicologist, Leiden University Medical Center
      • Dr PC Noordam, consultant (until 19 February 2004)
         Ministry of Social Affairs and Employment, The Hague
      Committee                                                                              127
</pre>

====================================================================== Einde pagina 127 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 128 ======================================================================

<pre>    •  Dr H te Riele
       molecular biologist; The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam
    •  Dr H Roelfzema, consultant
       Ministry of Health, Welfare and Sport, The Hague
    •  Prof. W Slob
       Professor of Quantitative Risk Assessment, University of Utrecht; also National
       Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven
    •  Prof. ALM Verbeek
       Professor of Clinical Epidemiology, Radboud University Nijmegen
    •  Prof. AA van Zeeland (from 1 February 2004, chairman from 1 September 2004)
       Professor of Molecular Radiation Dosimetry and Radiation Mutagenesis, Leiden
       University Medical Center
    •  Prof. EJJ van Zoelen
       Professor of Cell Biology, Radboud University Nijmegen
    •  Dr JA van Zorge, consultant
       Ministry of Housing, Spatial Planning and the Environment, The Hague
    •  Dr PW van Vliet, secretary
       Health Council, The Hague
    The following experts contributed to this advisory report:
    • Dr J van Benthem
       genetic toxicologist; National Institute of Public Health and the Environment,
       Bilthoven
    • Dr GR Douglas
       genetic toxicologist; Health Canada, Ottawa, Canada
    • Dr CAM Krul
       genetic toxicologist; TNO Nutrition and Food Research, Zeist
    • Prof. IB Lambert
       Professor of Biology and Biochemistry, Carleton University, Ottawa, Canada
    • Dr MD Shelby
       genetic toxicologist; National Institute of Environmental Health Sciences, Research
       Triangle Park, USA
    • Dr V Thybaud
       genetic toxicologist; Aventis Pharma, Vitry-sur-Seine, France
128 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 128 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 129 ======================================================================

<pre>Annex C
      List of concepts
      carcinogenic                 cancer inducing
      DNA                          genetic material
      endogenous                   present in the natural situation
      gene                         carrier of a genetic characteristic
      genetically modified animals animals, each of whose body cells contain DNA which has been changed in the
                                   same way
      gene mutation                changes within a gene, such as base-pair substitutions (the replacement of DNA
                                   base pairs by other base pairs) and minor deletions (the loss of sections of DNA)
      genotoxicity                 the ability to induce potentially harmful changes to an organism's DNA
      sensitivity                  the chance of a genotoxic substance yielding a positive score
      mutagenicity                 ability to cause mutations
      mutation                     permanent, transmissible change in the amount or structure of genetic material
                                   within cells or organisms
      mutation frequency           the number of mutations per copy of the reporter gene
      negative predictive value    the chance that a negative score means that the substance is not genotoxic
      positive predictive value    the chance that a substance which yields a positive score is indeed genotoxic
      reporter gene                gene that is investigated for the presence of gene mutations
      specificity                  the chance of a non-genotoxic substance yielding a negative score
      transgenic                   introduced by means of genetic modification
      List of concepts                                                                                            129
</pre>

====================================================================== Einde pagina 129 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 130 ======================================================================

<pre>130 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 130 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 131 ======================================================================

<pre>Annex        D
             Summary of substances and their test
             results
substance             carcinogenicitya genotoxicityb            BBc  MM organs/                references
                                                                        tissuesd               BB/MM
                                       in vitro   in vivo total
genotoxic
                                                                e                              32
2-acetylaminofluorene +                +          +       +          +  liver 1.6
                                                                                               33
                                                                     +  liver 5
                                                                                               34
                                                                +(m)    liver 3
                                                                                               35
                                                                     +  liver 3
                                                            36                                 37
acrylamide            + (2A)           +          +       +          +  bone marrow 6
                                                                                               38
                                                                     -  liver 2
                                                                                               39
                                                                     +  bone marrow 3
                                                                                               40
adozelesin                             +          +       +     +(m)    liver 3
                                                            41                                 42
aflatoxin             + (1)            +          +       +     -(m)    liver 4, kidney 3
                                                                                               43, 44
                                                                +(r)    liver 3
                                                                                               45
                                                                -(m)    liver 1.3
                                                                                               45
                                                                +(r)    liver 20
                                                                                               46
o-aminoazotoluene     + (2B)           +          +       +          +  liver 3, colon 6, bone
                                                                        marrow 1, lung 1.2,
                                                                        kidney 3, bladder 2,
                                                                        testis 3
             Summary of substances and their test results                                             131
</pre>

====================================================================== Einde pagina 131 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 132 ======================================================================

<pre>                                                                                                        47
4-aminobiphenyl           +(1)            +       +         +                + bladder 14, liver 5,
                                                                               bone marrow 2
                                                                                                        48
                                                                      +(r)     liver 3, kidney 7,
                                                                               bladder 4
                                                                                                        49,50
2-amino-3,4-dimethylimi- + (2B)           +       +         +         +(m)     colon 38, bone mar-
dazo[4,5-ƒ]quinoline                                                           row 6, liver 5, fore-
(MeIQ)                                                                         stomach 3
                                                                                                        51
2-amino-3,8-dimethylimi- + (2B)           +       +         +                + liver 4
dazo[4,5-ƒ]quinoxaline                                                +(m)     liver 9, colon 4         52
(MeIQx)                                                                      + liver 55                 53
                                                                                                        54
2-amino-3-methylimi-      + (2A)          +       +         +         +(r)     liver 4, colon 3, kid-
dazo[4,5-ƒ]quinoline (IQ)                                                      ney 2
                                                                                                        51
                                                                             + liver 4
                                                                                                        55
2-amino-1-methyl-6-phe- +(2B)             +       +         +                + large intestine 6,
nylimidazo[4,5-b]pyridine                                                      small intestine 4, liver
(PhIP)                                                                         1.6, kidney 1
                                                                                                        56
                                                                      +(r)     colon 25
                                                                                                        57
                                                                      +(r)     prostate 20
                                                                                                        58
                                                                      +(r)     caecum 7, colon 21
                                                                                                        59
                                                                      +(r)     colon 16
                                                                                                        60
                                                                      +(r)     prostate 5
                                                                                                        61
                                                                      +(m)     colon 3
                                                                                                        51
2-amino-9H-pyrido[2,3-    + (2B)          +       +         +                + liver 3
b]indole (AαC)
arsenic trioxide          +(1)            +       +         +62              - lung 1.0, kidney 1.0, 63
                                                                               bone marrow ?, blad-
                                                                               der ?
benzene                   + (1)           +       +         +64       +(m)     bone marrow 1.5,         65
                                                                               spleen 1.5, lung 1.3
benzo[a]pyrene            + (2A)          +       +         +66              + skin 11, liver 0.9,      67
                                                                               lung 1.1
                                                                             + colon 37, ileum 24, 68
                                                                               forestomach 15, bone
                                                                               marrow 18, spleen 25,
                                                                               stomach 9, liver 5,
                                                                               lung 4, kidney 4,
                                                                               heart 2, brain 1.5
                                                                                                        69,70
                                                                      +(m)     spleen 13
                                                                                                        71
                                                                      +(r)     lung 2
                                                                                                        72
                                                                      +(m)     splenic T-cells 9
132            The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 132 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 133 ======================================================================

<pre>                                                                                                73,74
1,3-butadiene             + (2A)      +         +          +          + lung 2, bone marrow
                                                                        0.7, liver 1.3
                                                                                                74
                                                                 +(m)   bone marrow 4
                                                                                                75
                                                                 +(m)   bone marrow 6
                                                                                                76
                                                                 +(m)   bone marrow 4
                                                                                                40
CC-1065                               +         +          +     +(m)   liver 3
                                                                                                37
chlorambucil              + (1)       +         +          +          + bone marrow 3, liver
                                                                        10, testis 22
                                                                                                39
                                                                      + bone marrow 2
                                                             41                                 77-79
4-chloro-o-phenylenedi-   + (2B)      +         +          +     +(m)   liver 8
amine
chromium(VI compounds + (1)           +         +          + 80       + bone marrow 1, liver    81
                                                                        2
                                                                                                82
                                                                      + bone marrow 2, liver
                                                                        2
                                                                 +(m)   lung 5, kidney 4, liver 83
                                                                        4
cisplatin                 + (2A)      +         +          + 84       + liver 2                 85
                                                              41
cyclophosphamide          + (1)       +         +          +     +(m)   lung 3, bladder 3, kid-86
                                                                        ney 1.4, bone mar-
                                                                        row 1.5
                                                                                                37
                                                                      + bone marrow 6
                                                                                                87
                                                                 +(m)   testis 0.9, spleen 0.8,
                                                                        liver 1.9
                                                                                                69,70
                                                                 +(m)   spleen 3
                                                                                                39
                                                                      + bone marrow 3
                                                                                                88
                                                                 -(m)   splenic T-lympho-
                                                                        cytes 1.2
                                                                                                89
cyproterone acetate       + (2B)      +         +          +     +(r)   liver 4
                                                                                                90,91
2,4-diaminotoluene        + (2B)      +                    +     +(m)   liver 2
                                                                                                78
                                                                 +(m)   liver 2
                                                                                                92
di-ethylnitrosamine (DEN) + (2A)      +         +          +          + bone marrow 1, liver
(N-ethyl-N-nitroso-etha-                                                7
namine)                                                               + liver 19                93
                                                                      + bone marrow approx. 94
                                                                        1, liver approx. 3
                                                                      + liver 6, kidney 2, lung 95
                                                                        2, bladder 1.1, bone
                                                                        marrow 1.3, testis 0.8
              Summary of substances and their test results                                            133
</pre>

====================================================================== Einde pagina 133 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 134 ======================================================================

<pre>dimethylnitrosamine      + (2A)         +       +         +96       +(m)     liver 4, bladder 1      97
(DMN) (N-ethyl-N-                                                   +(m)     liver 3                 90,91
nitroso-methanamine)                                                +(m)     liver 37                98
                                                                                                     99
                                                                    +(m)     liver 16
                                                                           + nasal mucosa 10, lung 100
                                                                             1.2, liver 2
                                                                                                     101
                                                                    +(m)     liver 2
                                                                                                     101
                                                                           + liver 5
                                                                                                     102
                                                                    +(m)     liver 2
                                                                                                     103
                                                                    +(m)     liver 6
                                                                    +(m)     forestomach 1.1, liver 104,105
                                                                             2, lung 1.2
                                                                    +(m)     liver 6, kidney 2, lung 95
                                                                             2, bone marrow 1.3,
                                                                             bladder 1.3, testis 0.8
                                                                                                     106
                                                                           + liver 5, spleen 3
                                                                                                     22
                                                                    +(m)     liver 4
                                                                                                     22
                                                                           + liver 6
                                                                                                     35
                                                                           + liver 5
                                                                                                     107
6-(p-dimethylaminopheny- +              +       +         +         +(r)     liver 10
lazo)benzothiazole
                                                                                                     108
7,12-dimethyl-           +              +       +         +                + skin 3
benz[a]anthracene                                                          + skin 15                 109
(DMBA)                                                                     + bone marrow 30, liver 110
                                                                             12, colon 3, thymus 4,
                                                                             skin 3, kidney 1.1,
                                                                             testis 3
                                                                                                     37
                                                                           + bone marrow 3, skin
                                                                             6
                                                                                                     111
                                                                    +(m)     skin 6
                                                                                                     39
                                                                           + skin 4
                                                                                                     46
                                                                           + liver 2, colon 1.5,
                                                                             bone marrow 9, lung
                                                                             0.5, kidney 1, blad-
                                                                             der 1.6, testis 5
                                                                                                     112
5, 9-dimeth-             +                      +         +                + liver 58
yldibenzo[c,g]carbazole                                                    + liver 3                 113
134          The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 134 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 135 ======================================================================

<pre>ethylene oxide          + (2A)       +         +          +114 +(m)   lung 1.4, spleen 2,     115
                                                                      sperm -
                                                               +(m)   lung 1.5, bone mar- 116
                                                                      row 1.9, spleen 1.9,
                                                                      sperm ducts from tes-
                                                                      tis 1.0, splenic B- and
                                                                      T-cells 4
ethyl methanesulphonate + (2B)       +         +          +84       + sperm from epididy-     117
                                                                      mis and vas deferens
                                                                      2
                                                                                              118
                                                                    + small intestine 2,
                                                                      spleen 3
                                                                                              92
                                                                    - liver 1, bone marrow
                                                                      2, brain 1.5
                                                                                              119
                                                                    + bone marrow 5, liver
                                                                      1.8
N-ethyl-N-nitrosourea   + (2A)       +         +          +         + liver 2.0, spleen 18, 120
(ENU)                                                                 bone marrow 19,
                                                                      brain 1.6, lung 2, kid-
                                                                      ney 2, bladder 11,
                                                                      heart 2
                                                                                              121
                                                                    + sperm from testis 5
                                                                                              122
                                                                    + small intestine 28
                                                                                              123
                                                                    + heart 5, small intes-
                                                                      tine 1.3
                                                                                              124
                                                               +(r)   liver 11, uterus 14
                                                                                              125
                                                                    + sperm from epididy-
                                                                      mis and vas deferens
                                                                      9
                                                                                              117
                                                                    + sperm from epididy-
                                                                      mis and vas deferens
                                                                      6
                                                                                              118
                                                                    + small intestine 11,
                                                                      spleen 6
                                                                                              126
                                                                    + spleen 14
                                                                                              127
                                                                    + sperm from testis 18,
                                                                      from vas deferens 4
                                                                    + bone marrow 34, liver 128
                                                                      11
                                                                                              129
                                                                    + sperm from testis 16,
                                                                      from epididymis 9
                                                               +(m)   sperm ducts from tes- 130
                                                                      tis 1.5, sperm from
                                                                      the epididymis 2
             Summary of substances and their test results                                         135
</pre>

====================================================================== Einde pagina 135 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 136 ======================================================================

<pre>                                                                           + bone marrow 40, liver 37
                                                                             27, testis 32
                                                                           + bone marrow 31, liver 81
                                                                             6
                                                                           + bone marrow 50, liver 131
                                                                             3, testis 2, epididy-
                                                                             mis 2
                                                                                                    26
                                                                           + testis 10
                                                                    +(m)     sperm ducts from tes- 69,70
                                                                             tis 4, spleen 8
                                                                                                    38
                                                                           + liver 7
                                                                                                    132
                                                                           + testis 7
                                                                                                    92
                                                                           + liver 4, bone marrow
                                                                             23, brain -
                                                                                                    40
                                                                    +(m)     liver 3
                                                                                                    133
                                                                           + (liver 1, embryonic
                                                                             liver 4)
                                                                           + bone marrow 40, liver 39
                                                                             17
                                                                                                    134
                                                                    +(m)     sperm from testis 20
                                                                    +(m)     sperm ducts from tes- 135
                                                                             tis 3, sperm from the
                                                                             epididymis 0.7
                                                                                                    73,74
                                                                           + lung 4, bone marrow
                                                                             24, liver 5
                                                                                                    74
                                                                    +(m)     bone marrow 20
                                                                                                    75
                                                                    +(m)     bone marrow 35
                                                                                                    136
                                                                    +(m)     splenic T-cells 8
                                                                                                    94
                                                                           + bone marrow, liver
                                                                           + bone marrow 10, liver 119
                                                                             2
                                                                           + sperm ducts from tes- 137
                                                                             tis 5, sperm from epi-
                                                                             didymis and vas
                                                                             deferens 1.3
                                                                                                    138
                                                                           + testis 16
                                                                                                    139
                                                                    +(m)     splenic T-cells 3
                                                                    +(m)     sperm ducts from tes- 140
                                                                             tis 5
                                                                                                    35
etoposide               +(2A)           +       +         +                + bone marrow 1.3
                                                                                                    141
hydrazine sulphate      +               +       +         +                - (lung 1.3, liver 1.3,
                        (hydrazine 2B)  (hydra- (hydra-   (hydra-            bone marrow 0.9)
                                        zine)   zine)     zine)
136          The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 136 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 137 ======================================================================

<pre>                                                                                             142
N-hydroxy-2-acetylami-   +           +         +          +   +(r)   liver 40, spleen 3
nofluorene                                                         - liver 2                 143
                                                                                             129
Isopropyl methanesulpho- +                     +          +        + testis 7, epididymis 4
nate                                                          +(m)   sperm ducts from tes- 130
                                                                     tis 1.3
                                                                   + testis 5, epididymis 3, 26
                                                                     vas deferens 4
                                                                                             132
                                                                   + testis 2
                                                              +(m)   sperm ducts from tes- 135
                                                                     tis 3, sperm from the
                                                                     epididymis 0.8
                                                                                             138
                                                                   + testis 4
                                                                                             144
methyl bromide           +/- (3)     +         +          +        - (liver 1.3, glandular
                                                                     stomach 0.7)
                                                                                             145
3-methylcholanthrene     +           +         +          +   +(m)   liver 1.3, forestom-
                                                                     ach 0.8
methyl methanesulphonate + (2B)      +         +          +84      - sperm from testis 1.3   121
                                                                                             117
                                                                   + sperm from epididy-
                                                                     mis and vas deferens
                                                                     1.5
                                                                   - sperm ducts from tes- 129
                                                                     tis 1.3, sperm from
                                                                     the epididymis 1.1
                                                              -(m)   sperm ducts from tes- 130
                                                                     tis 1.1
                                                                   - testis 1.3, sperm from 146
                                                                     epididymis and vas
                                                                     deferens 1.0, spleen
                                                                     1.1
                                                                                             132
                                                                   - testis 1
                                                                                             99
                                                              +(m)   liver 1.7
                                                              -(m)   sperm ducts from tes- 135
                                                                     tis 1.3, sperm from
                                                                     the epididymis 0.9
                                                                   - sperm ducts from tes- 137
                                                                     tis 1.2, sperm from
                                                                     epididymis and vas
                                                                     deferens 1.1
                                                                   - testis 1.2, sperm from 138
                                                                     epididymis 0.9
                                                                                             35
                                                                   - liver 2, bone marrow
                                                                     1.5
                                                              -(m)   sperm ducts from tes- 140
                                                                     tis 1.4
             Summary of substances and their test results                                        137
</pre>

====================================================================== Einde pagina 137 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 138 ======================================================================

<pre>                                                                                                       147
N-methyl-N’-nitro-N-     + (2A)          +       +         +                + stomach 6, liver -,
nitroso-guanidine (MNNG)                                                      bone marrow -
                                                                                                       148
                                                                            + stomach 19
                                                                            + stomach 13, liver 1.3, 109
                                                                              skin 78
                                                                                                       39
                                                                            + skin 5
                                                                                                       117
N-methyl-N-nitroso-urea + (2A)           +       +         +                + sperm from epididy-
(MNU)                                                                         mis and vas deferens
                                                                              6
                                                                                                       118
                                                                            + small intestine 6,
                                                                              spleen 2
                                                                                                       70
                                                                     +(m)     spleen 75, liver 11
                                                                                                       149
                                                                     +(m)     splenic T-cells 3
                                                                                                       150
                                                                     +(m)     brain 3, lung 23,
                                                                              sperm 6
                                                                     +(m)     forestomach 1.3, liver 104,105
                                                                              2, lung 1.2, kidney 1
                                                                                                       151
                                                                     +(m)     spleen 12
mitomycin-C              + (2B)          +       +         +84              + (bone marrow 1.7,        152
                                                                              liver 0.5)
                                                                                                       153
4-nitroquinoline-1-oxide +               +       +         +                + tongue 39, oesopha-
                                                                              gus 20, pooled oral
                                                                              tissues 54
                                                                                                       154
                                                                            + tongue 34, oesopha-
                                                                              gus 24, pooled oral
                                                                              tissues 15, lung 0.8,
                                                                              liver 0.7, colon 0.8
                                                                                                       155
                                                                            + liver 9, bone marrow
                                                                              51, testis 3, kidney
                                                                              1.2, spleen 1.2, lung
                                                                              1.6, stomach 55
                                                                                                       156
N-nitroso-dibenzylamine                  +       +         +                + bone marrow 1.7,
                                                                              liver 4
N-nitroso-dipropylamine  + (2B)          +       +         +                + bone marrow 2, liver 157
                                                                              12, lung 3, kidney
                                                                              1.4, bladder 1.0, testis
                                                                              0.5
                                                                                                       158
N-propyl-N-nitroso-urea  +                       +         +                + bone marrow 8, liver
                                                                              2, lung 1.9, kidney 2,
                                                                              spleen 3, testis 4,
                                                                              brain 1.0, heart 2
procarbazine             + (2A)          +       +         +41              + bone marrow 91           37
                                                                                                       39
                                                                            + bone marrow 30
138           The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 138 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 139 ======================================================================

<pre>                                                                                              147
β-propiolactone             + (2B)       +      +          +         + stomach 9, liver 2,
                                                                       bone marrow -
                                                                                              148
                                                                     + stomach 11
                                                                                              159
streptozotocin              + (2B)       +      +          +    +(m)   liver 2, kidney 6
                                                                                              124
tamoxifen                   + (1)        +      +          +    +(r)   liver 3, uterus 0.4
                                                                                              43 44
                                                                +(r)   liver 3
thiotepa                    + (1)        +      +          +41  +(r)   splenic lymphocytes    160
                                                                       4
tris(2,3-dibromopropyl)-    + (2A)       +      +          +41  +(m)   kidney 1.5, stomach    65
phosphate                                                              1.5, liver 1.2
                                                                                              161
                                                                +(r)   renal cortex 6, renal
                                                                       medulla (interior) 2,
                                                                       renal medulla (exte-
                                                                       rior) 4
urethane                    + (2B)       +      +          +84  +(m)   forestomach 1.5, liver 104,105
                                                                       5, lung 7
non-genotoxic
                                                                                              97
o-anisidine                 + (2B)       +      -          -    +(m)   liver 1.5, bladder 2
                                                                                              33
di(2-ethylhexyl)phthalate +/- (3)        +/-    -          -    -(m)   liver 1.7
                                                                                              33
phenobarbital               + (2B)       +/-    -          -    -(m)   liver 1.2
                                                                                              98
                                                                -(m)   liver approx. 1
                                                                                              162
                                                                     + liver 1.4
                                                                                              113
                                                                     - liver 1.1
                                                                                              33
heptachlor                  +/-(3)       +/-    -          -    -(m)   liver 2
                                                                                              131
levofloxacine                            +      -          -         - bone marrow 1.0,
                                                                       liver 1.2, testis 1.0,
                                                                       epididymis 1.3
                                                                                              163
methyl clofenapate          +            -      -          -    -(m)   liver 1.2
                                                                                              163
                                                                     - liver 0.8
                                                                                              78
2-nitro-p-phenylenedi-      + (3)        +      -          -    +(m)   liver 2
amine
                                                                                              103
oxazepam                    + (2B)       +      -          -    +(r)   liver 1.9
                                                                                              164
peroxyacetyl nitrate                     +      -          -    +(m)   lung 1.3
                                                                                              48
saccharin (sodium salt)     +/- (3)      +      -          -    -(r)   liver 1.2, (bladder 0)
tetrachloromethane          + (2B)       +/-    -          -165 -(m)   liver approx. 1        98
                                                                                              113
                                                                     - liver 1.6
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo- + (1)        -      -          -166 -(r)   liver 1.0              167
p-dioxin
genotoxicity insufficiently investigated
                                                                                              168
4-acetylaminofluorene       -                                   -(?)   liver -, bladder -
              Summary of substances and their test results                                            139
</pre>

====================================================================== Einde pagina 139 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 140 ======================================================================

<pre>                                                                                                      169
aristolochic acid        +               +                                  + forestomach 33, kid-
                                                                              ney 10, bladder 16,
                                                                              colon 9, stomach 3,
                                                                              lung 2, liver 1, bone
                                                                              marrow 2, spleen 3,
                                                                              testis 1.5
                                                           170                                        171
asbestos                 + (1)           +                           +(m)     lung 2
                                                                                                      71
                                                                     +(r)     lung 1.6
                                                                                                      172
                                                                     +(r)     lung 2
                                                                                                      173
                                                                     +(r)     omentum 3
                                                                                                      39
acetic acid                              -                                  + skin 8
                                                                                                      90,91
2,6-diaminotoluene       -               +                           -(m)     liver 1.0
                                                                                                      174
1-(2-chloroethyl)-3-(4-  + (1)                                       -(m)     bone marrow 9, liver
methylcyclohexyl)-1-                                                          -
nitrosourea (Methyl-
CCNU)
                                                                                                      109
1-chloro-methylpyrene                    +                                  + stomach 1.3, skin 10
                                                                                                      175
dichloroacetic acid      +/- (3)         -       +/-                 +(m)     liver 2
dimethylarsinic acid                     +                                  - lung 1.3, kidney 1.0, 63
                                                                              bone marrow ?, blad-
                                                                              der ?
                                                                                                      108
6,11-dimethyl-           +               +                                  + skin 5
benzo[b]naphtho-[2,3-
d]thiophene
                                                                                                      176
eugenol                  +/- (3)         +/-                                - liver 0.9
                                                                                                      177
3-fluoroquinoline        -               -                                  - liver 1.0, bone mar-
                                                                              row 1.1, testis 1.6
                                                                                                      177
5-fluoroquinoline        + rat           +                                  + liver 5, bone marrow
                                                                              1.4, testis 1.6
                                                                                                      42
phorone                                                              -(m)     liver 2, kidney 2
                                                                                                      178
leucomalachite green                     +/-                         +(r)     liver 3
                                                                                                      48
D-limonene               +/- (3)         -                           -(r)     liver 1.1, kidney 1.1
                                                                                                      151
7-methoxy-2- nitronaph-  +               +                           +(m)     spleen 2, testis 1,
tho[2,1-b]furan                                                               stomach 1, oesopha-
                                                                              gus 1.3, liver 0.8,
                                                                              small intestine 3, cae-
                                                                              cum 4, colon 2, blad-
                                                                              der 2
                                                                     +(m)     small intestine 5, cae- 179
                                                                              cum 5
                                                                                                      177
quinoline                +               +                                  + (liver 4, bone mar-
                                                                              row 1.5, testis 1.4)
                                                                                                      106
                                                                            + liver 4; kidney, lung
                                                                              and spleen approx. 1
140           The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals
</pre>

====================================================================== Einde pagina 140 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 141 ======================================================================

<pre>                                                                                                                                     43 44
toremifen                     +/- (3)             +/-         +/-                   -(r)                     liver 1.4
                                                                                                                                     180
trans-4-hydroxy-2-nonenal                         +                                 -(m)                     lung 1.1, liver 2, kid-
                                                                                                             ney 1.1
                                                                                                                                     181
uracil                        +                                                     +(r)                     bladder 5
a
     The IARC classification is given in brackets:
     1: the substance is carcinogenic in humans
     2A: the substance is probably carcinogenic in humans (limited evidence in humans, sufficient evidence in experimental animals)
     2B: the substance is possibly carcinogenic in humans (limited evidence in humans, and less than sufficient evidence in experimen-
     tal animals, or inadequate evidence in humans, but sufficient evidence in experimental animals)
     3: the substance cannot be classified in terms of its carcinogenicity in humans (the substance is placed in this group if it does not fit
     into any of the other groups)
     4: the substance is probably not carcinogenic in humans (evidence indicating the absence of carcinogenic properties in humans and
     in experimental animals)
b
     In vitro, in vivo and total genotoxicity. In the overall verdict, more weight is given to the in vivo results. The verdict is based on
     classical genotoxicity assays and on indirect evidence from sources such as studies into the formation of DNA adducts
c
     (m): mouse; (r): rat; (?): animal species not reported; +: at least one organ or tissue positive; -: all of the of the organs and tissues
     assayed are negative
d
     organs and tissues investigated with quotient of mutation frequencies of treated and control groups (the values in brackets are low;
     this is a result of the pooled analysis per group or missing information about statistical processing); the highest value where there
     are multiple assay designs; -: no statistically significant increase in MF, but quotient unreported; ?: no verdict possible (group size
     too small)
e
     +: positive; +/-: dubious; - negative; empty cell: insufficiently investigated, or not at all.
                Summary of substances and their test results                                                                               141
</pre>

====================================================================== Einde pagina 141 =================================================================

<br><br>====================================================================== Pagina 142 ======================================================================

<pre>142 The use of reporter genes for mutagenicity testing in animals</pre>

====================================================================== Einde pagina 142 =================================================================

<br><br>