Development of molecular methods for detection and epidemiological investigation of HIV-1, HIV-2, and HTLV-I/II infections | RIVM

Het onderzoek dat hier wordt gepresenteerd werd gestart om de mogelijkheden van moleculaire methoden voor detectie en epidemiologisch onderzoek van HIV en HTLV infecties te onderzoeken. We presenteren de resultaten van een literatuurstudie en beschrijven de ontwikkeling en gedeeltelijke evaluatie van een PCR methode voor de amplificatie van RNA en DNA sequenties van HIV-1 pol, env en gag, HIV-2 ltr en HTLV-I/II tax/rex genen. Voor de amplificatie van viraal RNA werden de monsters behandeld met guanidine thiocyanaat en natrium-lauryl-sarcosinaat om het virus kapot te maken en om RNAses te inactiveren. Paramagnetische bolletjes werden gebruikt om het RNA te extraheren gevolgd door solid-phase reverse-transcriptie voor cDNA synthese. Een twee-staps PCR protocol werd gebruikt voor de amplificatie van DNA of cDNA, waarbij het produkt van de eerste PCR verder wordt geamplificeerd in een tweede PCR met nested primers gecombineerd met een touch-down temperatuur protocol, om de gevoeligheid en specificiteit te verhogen. Een pilotstudie laat zien dat in alle perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters van zeven HIV-1 geinfecteerde individuen uit CDC klasse II, proviraal HIV-1 detecteerbaar was gebruik makend van drie primersets. HIV-1 RNA was detecteerbaar in plasma van 10 van vijftien HIV-1 geinfecteerde individuen uit CDC klasse II. Samen met gegevens uit de literatuur geven onze resultaten een indicatie dat PCR methoden bruikbaar zijn voor detectie van HIV infecties als toegevoegde methode aan de conventionele methoden zoals de enzym-immunoassays en de westernblot. Ze zijn speciaal geschikt als met de conventionele methoden geen duidelijke diagnose gesteld kan worden, zoals bijvoorbeeld bij borelingen van HIV geInfecteerde moeders, bij het volgen van de hoeveelheid aanwezig virus en bij patienten met een idiopatische CD4+ T-lymfocytopenie. Met dezelfde methode zijn HIV-2 en HTLV-I RNA en DNA sequenties geamplificeerd. Echter, deze methoden moeten nog klinisch geevalueerd worden. Deze nieuw ontwikkelde methode is mogelijk bruikbaar voor moleculair epidemiologische studies omdat het produkt van de HIV-1 env np-PCR, het V3 variabele gebied van glycoproteine gp120 gen, direct te sequencen was. Echter, moleculaire epidemiologie moet uitgevoerd worden op het nivo van moleculaire kloons van het virus in meer dan een gebied van het virale genoom. Voor moleculair epidemiologische studies van HIV-1 zijn, bijvoorbeeld, de variabele gebieden V3, V4 en V5 van het gp120 gen geschikte kandidaten. Veelbelovende methoden om materialen voor PCR en serologie bij epidemiologische veldstudies te verkrijgen zijn het gebruik van vingerprik-bloed op filter papier en van speeksel afname. Verdere studies zijn nodig om de waarde van deze methoden in moleculair epidemiologisch onderzoek vast te stellen.