Multi residue method using coupled-column HPLC and GC-MS for the determination of anabolic compounds in samples of urine | RIVM

Dit rapport beschrijft een multiresidu methode voor de analyse, detectie en identificatie van residuen van anabolica. De analytische methode is gebaseerd op een geautomatiseerde vaste faseextractie en een High Performance Liquid Chromatography (HPLC) kolomschakelingssysteem. Detectie vindt plaats met Gas Chromatografie met Massa Spectroscopische Detectie (GC-MS). De methode is geschikt voor de screening van urine monsters op 17 anabolica en de metabolieten daarvan. Gedeutereerde analoga worden gebruikt als interne standaarden voor kwantificering en kwaliteitscontrole. Na screening kan de identiteit van de anabolica bevestigd worden door het gebruik van een gemodificeerde HPLC-procedure met gradintelutie en selectieve fractionering. De geautomatiseerde extractie wordt uitgevoerd door een Gilson ASPEC systeem met wegwerp vaste fase extractie kolommen gekoppeld aan een HPLC met kolomschakeling. Het kolom schakelsysteem bestaat uit twee analytische kolommen gekoppeld via een schakelklep. Na extractie en HPLC zuivering wordt voor de screening een enkele fractie uitgevangen die alle analieten bevat. Deze fractie wordt in tweeen gedeeld en gederivatiseerd met twee verschillende derivatiseringsreagentia voor analyse met GC-MS. De detectielimiet voor alle componenten, behalve diethylstilbestrol (DES), is 1 microg/l. Voor DES bedraagt deze limiet 0.1 microg/l. De meerderheid van de componenten heeft een nauwkeurigheid tussen de 90 en 110 %. Voor drie componenten (4-chloro-4-androst-3,17-dione, methyltestosterone en 17-beta-nortestosterone) werd een grotere spreiding waargenomen. Voor alle componenten is de nauwkeurigheid acceptabel. Deze screeningsmethode is getest op vals negatieve resultaten door het analyseren van runder- (n=20), schapen- (n=20) en varkens- (n=10) urines op het concentratie niveau van n en twee maal de detectielimiet. De resultaten werden acceptabel geacht als het aantal vals negatieve resultaten kleiner of gelijk was aan 5%. Voor runder- en varkensurines op het niveau van 1 microg/l werd aan deze eis voldaan. Voor monsters schapenurines werden de resultaten op het concentratie van 2 microg/l geaccepteerd. De methode kan ook gebruikt worden als bevestigingsmethode. Voor dit doel wordt de te bevestigen analiet selectief gesoleerd door HPLC met gradientelutie en fractionering. De uitgevangen fractie wordt gederivatiseerd en bevestigd met GC-MS door het meten van ten minste 4 specifieke massafragmenten. De analysemethode is in detail beschreven in ARO SOP 401